Структура и химичен състав на хроматина. Химичен състав и ултраструктура на клетъчното ядро. Характеристики на структурата на нуклеолемата, хроматина и ядрото. Нива на организация на хроматина. Структурни и функционални компоненти на хроматина
Хроматинът е маса от генетична материя, съставена от ДНК и протеини, които кондензират, за да образуват хромозоми по време на еукариотно делене. Хроматинът се намира в нашите клетки.
Основната функция на хроматина е да компресира ДНК в компактна единица, която е по-малко обемиста и може да се побере в ядрото. Хроматинът се състои от комплекси от малки протеини, известни като хистони и ДНК.
Хистоните помагат за организирането на ДНК в структури, наречени нуклеозоми, осигурявайки основата за обвиване на ДНК. Нуклеозомата се състои от последователност от ДНК вериги, които се увиват около набор от осем хистона, наречени октомери. Нуклеозомата е допълнително сгъната, за да образува хроматиново влакно. Хроматиновите влакна се навиват и кондензират, за да образуват хромозоми. Хроматинът позволява редица клетъчни процеси, включително репликация на ДНК, транскрипция, възстановяване на ДНК, генетична рекомбинация и клетъчно делене.
Еухроматин и хетерохроматин
Хроматинът вътре в клетката може да бъде уплътнен в различна степен в зависимост от етапа на клетката в . Хроматинът в ядрото се съдържа под формата на еухроматин или хетерохроматин. По време на интерфазата клетката не се дели, а претърпява период на растеж. По-голямата част от хроматина е в по-малко компактна форма, известна като еухроматин.
ДНК е изложена на еухроматин, което позволява ДНК репликация и транскрипция. По време на транскрипцията двойната спирала на ДНК се развива и отваря, така че кодиращите протеини да могат да бъдат копирани. Репликацията и транскрипцията на ДНК са необходими на клетката, за да синтезира ДНК, протеини и в подготовка за клетъчно делене (или).
Малък процент от хроматина съществува като хетерохроматин по време на интерфазата. Този хроматин е плътно опакован, което не позволява генна транскрипция. Хетерохроматинът се оцветява с багрила в по-тъмен цвят от еухроматина.
Хроматин в митоза:
Профаза
По време на профазата на митозата хроматиновите влакна се превръщат в хромозоми. Всяка репликирана хромозома се състои от две хроматиди, свързани в .
метафаза
По време на метафазата хроматинът става изключително компресиран. Хромозомите са подредени върху метафазната плоча.
Анафаза
По време на анафазата сдвоените хромозоми () се разделят и изтеглят от микротубулите на вретеното към противоположните полюси на клетката.
Телофаза
В телофазата всеки нов се премества в собственото си ядро. Хроматиновите влакна се развиват и стават по-малко уплътнени. След цитокинезата се образуват две генетично идентични клетки. Всяка клетка има еднакъв брой хромозоми. Хромозомите продължават да се развиват и удължават образуващия се хроматин.
Хроматин, хромозома и хроматид
Хората често имат проблеми с разграничаването на термините хроматин, хромозома и хроматид. Въпреки че и трите структури са изградени от ДНК и се намират в ядрото, всяка се дефинира отделно.
Хроматинът се състои от ДНК и хистони, които са опаковани в тънки влакна. Тези хроматинови влакна не се кондензират, но могат да съществуват или в компактна форма (хетерохроматин), или в по-малко компактна форма (еухроматин). Процеси, включително репликация на ДНК, транскрипция и рекомбинация, протичат в еухроматина. По време на клетъчното делене хроматинът се кондензира, за да образува хромозоми.
Те са едноверижни структури от кондензиран хроматин. По време на процесите на клетъчно делене чрез митоза и мейоза, хромозомите се репликират, за да се гарантира, че всяка нова дъщерна клетка получава правилния брой хромозоми. Дублираната хромозома е двуверижна и има познатата форма X. Двете нишки са идентични и свързани в централна област, наречена центромер.
Това е една от двете вериги на репликирани хромозоми. Хроматидите, свързани с центромер, се наричат сестрински хроматиди. В края на клетъчното делене сестринските хроматиди се отделят от дъщерните хромозоми в новообразуваните дъщерни клетки.
Хетерохроматин - участъци от хромозоми, които са постоянно в компактно състояние.
Еухроматин - лошо опаковани (декондензирани) региони на хромозоми.
В близките центромерни области на хромозомите и късите рамена на акроцентричните хромозоми се оцветява хетерохроматинът, обозначен като структурен, който се открива постоянно както по време на митотично клетъчно делене, така и в интерфазното ядро. Друг тип хетерохроматин, факултативен, възниква от уплътняването на еухроматичните региони и съдържа гени, участващи в протеиновия метаболизъм. Кондензацията на факултативната област е обратима, което води до декондензация.
Хромозомите се състоят от ДНК (приблизително 40%) и протеини (приблизително 60%), образувайки нуклеопротеинов комплекс. Протеините се разделят на две групи: хистонови и нехистонови. Хистоните са представени от пет молекули: H1, H2A, H2B, H3 и H4. Хистоновите протеини съставляват 40 до 80% от всички хромозомни протеини. Те са съставени от малки (+) заредени молекули. В тях преобладават основните аминокиселини аргинин и лизин. Благодарение на тяхната структура хистоновите протеини се свързват с (-) заредена ДНК, образувайки ДНК-хистонов комплекс. Този комплекс се нарича хроматин. Гис. протеините изпълняват функцията на специфично опаковане на огромна ДНК молекула в компактна структура на хромозомата. Хистоните предотвратяват четенето на биологичната информация, съдържаща се в ДНК. Това е тяхната регулаторна роля. В допълнение, тези протеини изпълняват структурна функция, осигурявайки пространствената организация на ДНК в хромозомите.
Броят на фракциите на нехистоновите протеини надхвърля 100. Сред тях са ензими за синтез и обработка на РНК, редупликация и възстановяване на ДНК. Киселинните протеини на хромозомите също играят структурна и регулаторна роля. В допълнение към ДНК и протеини, РНК, липиди, полизахариди и метални йони също се намират в хромозомите. Хромозомната РНК е частично представена от продукти на транскрипция, които все още не са напуснали мястото на синтеза. Някои фракции имат регулаторна функция. Регулаторната роля на компонентите на хромозомите е да "забраняват" или "разрешават" отписването на информация от молекулата на ДНК.
В различните части на хромозомите ДНК се различава по състав и свойства.
В областта на първичните стеснения се намира центромерната ДНК. Теломерите съдържат специална ДНК, която предотвратява скъсяването на хромозомите по време на репликация. В зоните на вторични стеснения има участъци от ДНК, отговорни за синтеза на рРНК. В рамената на хромозомите се намира основната част от ДНК, която е отговорна за синтеза на множество информационни РНК.
Поддържайки приемственост в редица клетъчни поколения, хроматинът, в зависимост от периода и фазата на клетъчния цикъл, променя своя организация.В интерфазата със светлинна микроскопия се открива под формата на бучки, разпръснати в нуклеоплазмата на ядрото. По време на прехода на клетката към митоза, особено в метафазата, хроматинът приема формата на добре разграничени индивидуални интензивно оцветени тела - хромозоми.
Интерфазните и метафазните форми на съществуване на хроматин се разглеждат като два полярни варианта на неговата структурна организация, свързани в митотичния цикъл чрез взаимни преходи. Най-разпространената гледна точка е, че хроматинът (хромозомата) е спирална нишка. В същото време се разграничават няколко нива на спирализация (компактизация) на хроматина
Нуклеозомна нишка . Това ниво на организация на хроматина се осигурява от четири вида нуклеозомни хистони: H2A, H2B, H3, H4. Те образуват протеинови тела с форма на шайба - кора, състояща се от осем молекули (по две молекули от всеки вид хистон)
Хроматинови фибрили. По-нататъшното уплътняване на нуклеозомната верига се осигурява от буталото HI, което чрез свързване с линкерната ДНК и две съседни протеинови тела ги приближава едно до друго. В резултат на това се образува по-компактна структура, изградена вероятно като соленоид. Такава хроматинова фибрила, наричана още елементарна, има диаметър 20-30 nm
Интерфазна хромонема . Следващото ниво на структурна организация на генетичния материал се дължи на сгъването на хроматиновите фибрили в бримки. Очевидно в тяхното образуване участват нехистонови протеини, които са способни да разпознават специфични нуклеотидни последователности на екстрануклеозомна ДНК, разделени една от друга с няколко хиляди базови двойки. Тези протеини обединяват посочените области с образуването на бримки от фрагментите на хроматиновия фибрил, разположен между тях. В резултат на такова опаковане хроматинова фибрила с диаметър 20-30 nm се трансформира в структура с диаметър 100-200 nm, наречена интерфазна хромонема .
Отделни участъци от интерфазна хромонема претърпяват допълнително уплътняване, образувайки структурни блокове, които обединяват съседни бримки със същата организация.
Хромозоми на лампова четканамира се в овоцити на риби, земноводни, влечуги и птици в стадий диплотен. Всяка от двете хромозоми е двувалентна и се състои от две хроматиди, следователно, когато се конюгират, се образуват разширени четирихроматидни структури. Всеки хроматид се състои от плътно усукана аксиална верига със странични бримки, простиращи се от нея, образувана от единична двойна спирала на ДНК. Тези бримки вероятно представляват ДНК, освободена от протеини за транскрипция. Хромозоми като "l. ш." се транскрибират по-активно от обикновените xp-we. Това се дължи на необходимостта от натрупване на значителни количества генни продукти в овоцитите.
Лекция No 2.13.9.11. „Етапи на формиране на клетъчната теория. Клетката като структурна единица на живия живот
Етапи на формиране на клетъчната теория:
1) 1665 г. - Р. Хук дава името на клетката - "cellula"
2) 1839 - Шлейден и Шван предлагат нова клетка. теория
Клетка - структурната единица на растенията и животните
Процесът на образуване на клетки определя техния растеж и развитие
1858 - Вирхов добавя клетка. теория
"Всяка клетка от клетка"
3) модерна клетка. теория
Клетката е основната структурна и функционална единица на всички живи същества.
Клетките на един многоклетъчен организъм са сходни по структура, състав и важни прояви на жизнена дейност.
Размножаване - делене на оригиналната майчина клетка
Клетките на многоклетъчния организъм по функция и образуват тъкани → органи → системи от органи → организъм
Общ план на структурата на еукариотната клетка.
Трите основни компонента на клетката са:
1)цитоплазмена мембрана (плазмалема)
Двойният слой от липиди и един слой от протеини се намират на повърхността на липидния слой или са потопени в него.
Функции:
ограничаване
транспорт
Защитен
Рецептор (сигнал)
2)цитоплазма:
а) хиалоплазма (колоидален разтвор на протеини, фосфолипиди и други вещества. Може да бъде гел и зол)
Функции на хиалоплазмата:
транспорт
Хомеостатичен
Метаболизъм
Създаване на оптимални условия за функциониране на органелите
б) Органели - постоянни компоненти на цитоплазмата, дефинирани. строителство и изпълнение деф. функции.
Класификация на органелите:
○ по локализация:
Ядрени (нуклеоли и хромозоми)
Цитоплазма (ER, рибозоми)
○ по структура:
Мембрана:
а) едномембранни (лизозоми, ER, апарат на Голджи, вакуоли, пероксизоми, сферозоми)
б) двумембранни (пластиди, митохондрии)
Немембранни (рибозоми, микротубули, миофибрили, микрофиламенти)
○ с уговорка:
Често (намира се във всички клетки)
Специални (има в определени клетки - пластиди, реснички, флагели)
○ по размер:
Вижда се в светлинен микроскоп (EPS, апарат на Голджи)
Невидими под светлинен микроскоп (рибозоми)
Включвания- непостоянни компоненти на клетката, имащи дефин. строителство и изпълнение деф. функции.
3)ядро
Единична мембрана.
ER (ендоплазмен ретикулум, ретикулум).
Система от взаимосвързани кухини и тубули, свързани с външната ядрена мембрана.
Груб (гранулиран).Имат рибозоми → протеинов синтез
Гладка (гранулирана).Синтез на мазнини и въглехидрати.
Функции:
1) разделител
2) транспорт
3) отстраняване на токсични вещества от клетката
4) синтез на стероиди
Апарат на Голджи (ламеларен комплекс).
Купчини сплескани тубули и цистерни, които се наричат диктозоми.
Диктозома- купчина от 3-12 сплескани диска, наречени цистерни (до 20 dicto)
Функции:
1) концентрация, освобождаване и уплътняване на междуклетъчната секреция
2) натрупване на глико- и липопротеини
3) натрупване и отстраняване на вещества от клетката
4) образуване на бразда на делене по време на митоза
5) образуването на първични лизозоми
Лизома.
Везикула, заобиколена от единична мембрана и съдържаща хидролитични ензими.
Функции:
1) смилане на абсорбирания материал
2) унищожаване на бактерии и вируси
3) автолиза (разрушаване на клетъчни части и мъртви органели)
4) отстраняване на цели клетки и междуклетъчно вещество
Пероксизом.
Везикули, заобиколени от единична мембрана, съдържаща пероксидаза.
Функции- окисление орг. вещества
Сферозома.
Овални органели, заобиколени от единична мембрана, съдържаща мазнини.
Функции– синтез и натрупване на липиди.
Вакуоли.
Кухини в цитоплазмата на клетките, ограничени от единична мембрана.
В растенията (клетъчен сок - разтваряне на органични и неорганични вещества) и единични клетки. животни (храносмилателна, контрактилна - осморегулация и екскреция)
Двойна мембрана.
Ядро.
1)черупка (кариолема):
Две мембрани, пронизани с пори
Перинуклеарно пространство между мембраните
Външната мембоана е свързана със спешното отделение
Функции - защитни и транспортни
2)ядрени пори
3)ядрен сок:
Според физическите състояние, близко до хиалоплазма
от химическо състояниесъдържа повече нуклеинова киселина
4)нуклеоли:
Немембранни основни компоненти
Може да има един или повече
Образува се на специфични места в хромозомите (нуклеоларни организатори)
Функции:
синтез на рРНК
tRNA синтез
Образуване на рибозома
5)хроматин– нишки на ДНК + протеин
6)хромозома- силно спираловиден хроматин, който съдържа гени
7)вискозна кариоплазма
Ултраструктурата на хромозомите.
Хромозома → 2 хроматиди (свързани в областта на центромера) → 2 полухроматиди → хромонема → микрофибрили (30-45% ДНК + протеин)
СателитУчастък от хромозома, разделен от вторично стесняване.
Теломер- крайна област на хромозома
Видове хромозоми в зависимост от позицията на центромера:
1) равностранен (метоцентричен)
2) неравномерни рамене (субметацентрични)
3) пръчковидна (акроцентрична)
каротип- набор от данни за броя, формата и размера на хромозомите.
идиограма– графично изграждане на кариотип
Свойства на хромозомите:
1)постоянство на броя
При един вид броят на хромозомите винаги е постоянен.
2)сдвояване- в соматични клеткивсяка хромозома има своя собствена двойка (хомоложни хромозоми)
3)индивидуалност- всяка хромозома има свои собствени характеристики (размер, форма ...)
4)приемственост- всяка хромозома на хромозома
Функции на хромозомите:
1) съхранение на наследствена информация
2) предаване на наследствена информация
3) прилагане на наследствена информация
Митохондриите.
1) се състои от 2 мембрани:
Външен (гладък, отвътре има издатини - кристи)
Външен (груб)
2) В пространството, запълнено с матрица в ct., са:
Рибозоми
Протеините са ензими
Функции:
1) Синтез на АТФ
2) синтез на митохондриални протеини
3) синтез на ядра. киселини
4) синтез на въглехидрати и липиди
5) образуване на митохондриални рибозоми
Пластиди.
1) двумембранни органели
2) вътре в стромата, в ct. разположен tillakoides → grana
3) в стромата:
Рибозоми
Въглехидрати
По цвят те се разделят на:
1) хлоропласти (зелени, хлорофил) Фотосинтеза.
2) хромопласти:
Жълто (ксантофил)
Червени (ликопектин)
Портокал (каротин)
Оцветяване на плодове, листа и корени.
3) левкопласти (безцветни, не съдържат пигменти). Запас от протеини, мазнини и въглехидрати.
Немембранни.
Рибозома
1) се състои от rRNA, протеин и магнезий
2) две субединици: голяма и малка
функция - протеинов синтез
Хроматинът, основният компонент на клетъчното ядро, се получава доста лесно от изолирани интерфазни ядра и от изолирани митотични хромозоми. За да направите това, използвайте свойството му да преминава в разтворено състояние по време на екстракция с водни разтвори с ниска йонна сила или просто дейонизирана вода. В същото време хроматиновите участъци набъбват и се превръщат в гел. За да се прехвърлят такива препарати в реални разтвори, са необходими силни механични въздействия: разклащане, смесване, допълнителна хомогенизация. Това, разбира се, води до частично разрушаване на оригиналната структура на хроматина, разпада го на малки фрагменти, но практически не променя химичния му състав.
Хроматиновите фракции, получени от различни обекти, имат доста еднакъв набор от компоненти. Установено е, че общият химичен състав на хроматина от интерфазните ядра и митотичните хромозоми се различават малко един от друг. Основните компоненти на хроматина са ДНК и протеини, сред които по-голямата част са хистони и нехистонови протеини (вижте таблица 3).
Таблица 3Химичен състав на хроматина. Съдържанието на протеини и РНК е дадено във връзка с ДНК
Средно в хроматина около 40% са ДНК и около 60% са протеини, включително специфични ядрени протеини - хистони, съставляват от 40 до 80% от всички протеини, които изграждат изолирания хроматин. В допълнение, съставът на хроматиновата фракция включва мембранни компоненти, РНК, въглехидрати, липиди, гликопротеини. Въпросът как тези второстепенни компоненти са включени в структурата на хроматина все още не е разрешен. Така, например, РНК може да бъде транскрибирана РНК, която все още не е загубила връзката си с ДНК шаблона. Други второстепенни компоненти могат да бъдат вещества от съвместно утаени фрагменти от ядрената обвивка.
В структурно отношение хроматинът е нишковидна сложна молекула на дезоксирибонуклеопротеин (DNP), която се състои от ДНК, свързана с хистони (виж Фиг. 57). Следователно друго име за хроматин се вкорени - нуклеохистон. Именно поради свързването на хистоните с ДНК се образуват много лабилни, променливи нуклеиново-хистонови комплекси, където съотношението ДНК:хистон е приблизително равно на единица, т.е. те присъстват в равни тегловни количества. Тези нишковидни DNP фибрили са елементарни хромозомни или хроматинови нишки, чиято дебелина, в зависимост от степента на опаковане на ДНК, може да варира от 10 до 30 nm. Тези DNP фибрили могат от своя страна да се уплътнят допълнително с образуването на по-високи нива на DNP структуриране, до митотичната хромозома. Ролята на някои нехистонови протеини е именно в образуването на високи нива на уплътняване на хроматина.
хроматинова ДНК
В хроматиновия препарат ДНК обикновено представлява 30-40%. Тази ДНК е двуверижна спирална молекула, подобна на чиста изолирана ДНК във водни разтвори. Това се доказва от много експериментални данни. По този начин, когато разтворите на хроматин се нагряват, се наблюдава увеличаване на оптичната плътност на разтвора, така нареченият хиперхромен ефект, свързан с разкъсването на междунуклеотидните водородни връзки между нишките на ДНК, подобно на това, което се случва, когато чистата ДНК се нагрява (стопи) .
Въпросът за размера и дължината на ДНК молекулите в състава на хроматина е важен за разбирането на структурата на хромозомата като цяло. При стандартните методи за екстракция на ДНК хроматинът има молекулно тегло 7-9 x 10 6, което е много по-малко от молекулното тегло на ДНК от Escherichia coli (2,8 x 10 9). Такова относително ниско молекулно тегло на ДНК от хроматинови препарати може да се обясни с механично увреждане на ДНК по време на изолирането на хроматин. Ако обаче ДНК се изолира при условия, които изключват разклащане, хомогенизиране и други влияния, тогава от клетките могат да се получат ДНК молекули с много голяма дължина. Дължината на ДНК молекулите от ядрата и хромозомите на еукариотните клетки може да бъде изследвана с помощта на метода на светлинно-оптична радиоавтография, точно както беше изследвано върху прокариотни клетки.
Установено е, че в състава на хромозомите дължината на отделните линейни (за разлика от прокариотните хромозоми) ДНК молекули може да достигне стотици микрометри и дори няколко сантиметра. И така, от различни обекти са получени ДНК молекули от 0,5 мм до 2 см. Тези резултати показват, че има тясно съответствие между изчислената дължина на ДНК на хромозома и радиоавтографското наблюдение.
След лек лизис на еукариотни клетки е възможно директно определяне на молекулните маси на ДНК чрез физикохимични методи. Доказано е, че максималното молекулно тегло на ДНК молекула на Drosophila е 41 x 10 9, което съответства на дължина от около 2 см. При някои дрожди има ДНК молекула на хромозома с молекулно тегло 1 x 10 8 -10 9 , който е с размер около 0,5 mm .
Такива дълги ДНК са една молекула, а не няколко по-къси, омрежени с помощта на протеинови снопове, както смятаха някои изследователи. До този извод се стигна, след като се оказа, че дължината на ДНК молекулите не се променя след третиране на препарати с протеолитични ензими.
Общото количество ДНК, включено в ядрените структури на клетките, в генома на организмите, варира от вид на вид, въпреки че при микроорганизмите количеството ДНК на клетка е много по-ниско, отколкото при безгръбначните, висшите растения и животните. И така, в една мишка има почти 600 пъти повече ДНК на ядро, отколкото в E. coli. Сравнявайки количеството ДНК на клетка в еукариотните организми, е трудно да се види някаква връзка между степента на сложност на организма и количеството ДНК на ядро. Приблизително същото количество ДНК има различни организми като лен, морски таралеж, костур (1,4-1,9 pg) или овъглена риба и бик (6,4 и 7 pg).
Значителни колебания в количеството на ДНК в големи таксономични групи. Сред висшите растения количеството ДНК в различни видовеможе да се различава стотици пъти, точно както сред рибите количеството на ДНК при земноводните се различава десетки пъти.
При някои земноводни количеството на ДНК в ядрата е 10-30 пъти по-голямо, отколкото в човешките ядра, въпреки че човешката генетична конституция е несравнимо по-сложна от тази на жабите. Следователно може да се предположи, че "прекомерното" количество ДНК в по-ниско организираните организми или не е свързано с изпълнението на генетична роля, или броят на гените се повтаря един или друг брой пъти.
Таблица 4. Съдържанието на ДНК в клетките на някои обекти (pg, 10 -12 g)
Оказа се, че е възможно да се решат тези проблеми въз основа на изучаване на кинетиката на реакцията на ренатурация или хибридизация на ДНК. Ако фрагментираните ДНК молекули в разтвори се подложат на термична денатурация и след това се инкубират при температура, малко по-ниска от тази, при която се случва денатурацията, тогава първоначалната двойноверижна структура на ДНК фрагментите се възстановява поради повторното обединяване на комплементарни вериги - ренатурация. За ДНК на вируси и прокариотни клетки беше показано, че скоростта на такава ренатурация зависи пряко от размера на генома; колкото по-голям е геномът, толкова по-голямо е количеството ДНК на частица или клетка, толкова повече време е необходимо за случайно сближаване на комплементарни вериги и специфична реасоциация Повече ▼ДНК фрагменти, различни по нуклеотидна последователност (фиг. 53). Естеството на кривата на реасоцииране на ДНК на прокариотните клетки показва липсата на повтарящи се базови последователности в прокариотния геном; всички участъци от тяхната ДНК носят уникални последователности, чийто брой и разнообразие отразяват степента на сложност на генетичния състав на обектите и, следователно, тяхната цялостна биологична организация.
Напълно различна картина на реасоциацията на ДНК се наблюдава при еукариотните организми. Оказа се, че тяхната ДНК съдържа фракции, които се отгряват с много по-висока скорост, отколкото предполага размерът на генома им, както и фракция от ДНК, която се отгрява бавно, подобно на уникалните ДНК последователности на прокариотите. Еукариотите обаче изискват много по-дълго време, за да ренатурират тази фракция, което е свързано с общия голям размер на техния геном и с голям брой различни уникални гени.
В тази част от еукариотната ДНК, която се характеризира с висока скорост на ренатурация, се разграничават две подфракции: 1) фракция с много или често повтарящи се последователности, където подобни ДНК региони могат да се повторят 10 6 пъти; 2) фракция от умерено повтарящи се последователности, срещащи се в генома 10 2 -10 3 пъти. Така при мишки фракцията на ДНК с често повтарящи се последователности включва 10% от общото количество ДНК на геном, а 15% се падат на фракцията с умерено повтарящи се последователности. Останалите 75% от цялата миша ДНК е представена от уникални региони, съответстващи на голям брой различни неповтарящи се гени.
Фракциите с често повтарящи се последователности могат да имат различна плаваща плътност от по-голямата част от ДНК и следователно могат да бъдат изолирани в чиста формакато така наречените фракции сателитна ДНК. При мишки тази фракция има плътност от 1,691 g/ml, а по-голямата част от ДНК е 1,700 g/ml. Тези разлики в плътността се определят от разликите в нуклеотидния състав. Например, в една мишка тази фракция съдържа 35% двойки G и C, а в основния пик на ДНК - 42%.
Както се оказа, сателитната ДНК или фракция от ДНК с често повтарящи се последователности не участва в синтеза на основните типове РНК в клетката и не е свързана с процеса на синтез на протеини. Това заключение е направено въз основа на това, че нито един от видовете клетъчна РНК (tRNA, mRNA, rRNA) не хибридизира със сателитна ДНК. Следователно, тези ДНК не съдържат последователности, отговорни за синтеза на клетъчни РНК; сателитните ДНК не са матрици за синтеза на РНК и не участват в транскрипцията.
Съществува хипотеза, че много повтарящи се последователности, които не са пряко включени в протеиновия синтез, могат да носят информация, която играе важна структурна роля в запазването и функционирането на хромозомите. Те могат да включват многобройни ДНК области, свързани с протеини на гръбнака на интерфазното ядро (вижте по-долу), области на произхода на репликация или транскрипция, както и ДНК области, които регулират тези процеси.
Методът на хибридизация на нуклеинови киселини директно върху хромозомите ( на място) е изследвана локализацията на тази фракция. За тази цел РНК, белязана с 3 Н-уридин, се синтезира с помощта на бактериални ензими върху изолирана сателитна ДНК. След това цитологичният препарат с хромозоми се подлага на такава обработка, при която настъпва денатурация на ДНК (повишена температура, алкална среда и др.). След това върху препарата се поставя белязана с 3Н РНК и се постига хибридизация между ДНК и РНК. Радиоавтографски е установено, че повечето отетикетът е локализиран в зоната на първичните стеснения на хромозомите, в зоната на техните центромерни области. Етикетът се открива и в други части на хромозомите, но много слабо (фиг. 54).
През последните 10 години бяха направени големи крачки в изследването центромерна ДНКособено в клетките на дрождите. Така че y S.cerevisiaeцентромерната ДНК се състои от повтарящи се участъци от 110 bp. Състои се от две запазени области (I и III) и централен елемент (II), обогатен с AT базови двойки. Хромозомите на Drosophila имат подобна структура на центромерна ДНК. Човешката центромерна ДНК (алфаноидна сателитна ДНК) се състои от тандем от 170 bp мономери, организирани в групи от димери или пентамери, които на свой ред образуват големи последователности от 1-6 x 103 bp. Тази най-голяма единица се повтаря 100-1000 пъти. Тази специфична центромерна ДНК е в комплекс със специфични центромерни протеини, участващи във формирането кинетохор, структура, която осигурява връзката на хромозомите с вретеновидни микротубули и при движението на хромозомите в анафаза (виж по-долу).
ДНК със силно повтарящи се последователности също е открита в теломерни областихромозоми на много еукариотни организми (от дрожди до хора). Тук най-често се срещат повторения, които включват 3-4 гуанинови нуклеотида. При хората теломерите съдържат 500-3000 TTAGGG повторения. Тези участъци от ДНК играят специална роля - да ограничат хромозомата от краищата и да предотвратят нейното скъсяване в процеса на многократна репликация.
Наскоро беше установено, че силно повтарящи се ДНК последователности на интерфазни хромозоми се свързват специфично с протеини - ламини, които са под ядрената обвивка и участват в закрепването на разтегнати декондензирани интерфазни хромозоми, като по този начин определят реда в локализацията на хромозомите в обема на интерфазата ядро.
Предполага се, че сателитната ДНК може да участва в разпознаването на хомоложните области на хромозомите по време на мейозата. Според други предположения регионите с често повтарящи се последователности играят ролята на разделители (спейсъри) между различни функционални единици на хромозомна ДНК, например между репликони (виж по-долу).
Както се оказа, фракцията от умерено повтарящи се (от 102 до 105 пъти) последователности принадлежи към пъстър клас от ДНК региони, които играят важна роля в създаването на апарата за синтез на протеини. Тази фракция включва рибозомни ДНК гени, които могат да се повтарят в различни видове от 100 до 1000 пъти. Тази фракция включва множество повтарящи се сайтове за синтеза на всички тРНК. Освен това някои структурни гени, отговорни за синтеза на определени протеини, също могат да се повтарят много пъти, представени от много копия. Това са гени за хроматинови протеини - хистони, повтарящи се до 400 пъти.
В допълнение, тази фракция включва ДНК сегменти с различни последователности (100-400 нуклеотидни двойки всяка), също многократно повтарящи се, но разпръснати из целия геном. Тяхната роля все още не е напълно ясна. Предполага се, че такива ДНК региони могат да представляват акцепторни или регулаторни региони на различни гени.
И така, ДНК на еукариотните клетки е хетерогенна по състав, съдържа няколко класа нуклеотидни последователности: често повтарящи се последователности (> 10 6 пъти), които са част от сателитната ДНК фракция и не се транскрибират; фракция от умерено повтарящи се последователности (10 2 -10 5), представляващи блокове от истински гени, както и къси последователности, разпръснати из целия геном; част от уникални последователности, които носят информация за повечето клетъчни протеини.
Въз основа на тези идеи стават ясни разликите в количеството ДНК, които се наблюдават в различните организми: те могат да бъдат свързани с неравномерно съотношение на определени класове ДНК в генома на организмите. Например в амфибия Амфиума(която има 20 пъти повече ДНК от човек) до 80% от цялата ДНК е повтарящи се последователности, до 70% в лука, до 60% в сьомгата и т.н. Истинското богатство от генетична информация трябва да отразява частта от уникални последователности. Не трябва да се забравя, че в нативната, нефрагментирана ДНК молекула на хромозомата всички участъци, които включват уникални, умерено и често повтарящи се последователности, са свързани в една гигантска ковалентна ДНК верига.
ДНК молекулите са хетерогенни не само в участъци от различни нуклеотидни последователности, но също така се различават по своята синтетична активност.
Репликация на еукариотна ДНК
Бактериалната хромозома се репликира като една структурна единица с една начална точка на репликация и една крайна точка. Така бактериалната циклична ДНК е една репликон. От началната точка репликацията протича в две противоположни посоки, така че докато се синтезира ДНК, се образува така нареченото репликационно око, ограничено от двете страни с репликационни вилици, което се вижда ясно при изследване с електронен микроскоп на вирусна и бактериална репликация хромозоми.
В еукариотните клетки организацията на репликация от различно естество е полирепликон , Както вече беше споменато, с импулсното включване на 3 HT се появява множествен етикет в почти всички митотични хромозоми. Това означава, че едновременно в интерфазната хромозома има много места на репликация и много автономни точки на произход на репликация. Това явление беше изследвано по-подробно с помощта на автографи на белязани молекули, извлечени от ДНК (Фиг. 55).Ако клетките бяха пулсирани с 3 НТ, тогава в светлинен микроскоп могат да се видят зони с намалено сребро в автографите на изолирана ДНК в под формата на пунктирани линии. Това са малки сегменти от ДНК, които са успели да се репликират, а между тях има участъци от нерепликирана ДНК, която не е оставила радиография и следователно остава невидима. Тъй като времето за контакт на 3 NT с клетката се увеличава, размерът на тези сегменти се увеличава и разстоянието между тях намалява. От тези експерименти е възможно да се изчисли точно скоростта на репликация на ДНК в еукариотните организми. Установено е, че скоростта на движение на вилицата за репликация е 1–3 kb. на минута при бозайници, около 1 kb. на минута в някои растения, което е много по-ниско от скоростта на репликация на ДНК в бактерии (50 kb на минута). В същите експерименти беше директно доказана структурата на полирепликонната ДНК на еукариотните хромозоми: по дължината на хромозомната ДНК, по протежение на нея, има много независими места за репликация - репликони. Според разстоянието между средните точки на съседни маркиращи репликони, т.е. чрез разстоянието между две съседни начални точки на репликация може да се установи размерът на отделните репликони. Средно стойността на репликона на висшите животни е около 30 μm или 100 kb. Следователно трябва да има 20 000-30 000 репликони в хаплоидния набор от бозайници. При нисшите еукариоти размерът на репликоните е по-малък, около 40 kb. Така при Drosophila има 3500 репликона на геном, а при дрождите - 400. Както споменахме, синтезът на ДНК в репликона протича в две противоположни посоки. Това лесно се доказва чрез авторадиография: ако клетките, след импулсния етикет, се оставят да продължат да синтезират ДНК за известно време в среда без 3 HT, тогава включването му в ДНК ще намалее, сякаш ще настъпи разреждане на етикета и на радиоавтограф ще бъде възможно да се види симетрична репликирана област от двете страни, намалявайки броя на зърната редуцирано сребро.
Краищата или разклоненията на репликацията в репликона спират да се движат, когато срещнат разклоненията на съседните репликони (в крайна точка, обща за съседните репликони). На това място репликираните региони на съседни репликони се комбинират в единични ковалентни вериги от две новосинтезирани ДНК молекули. Функционалното разделяне на хромозомната ДНК на репликони съвпада със структурното разделяне на ДНК на домени или бримки, чиито основи, както вече беше споменато, се държат заедно чрез протеинови връзки.
По този начин целият ДНК синтез на една хромозома протича чрез независим синтез на много индивидуални репликони, последван от свързване на краищата на съседни ДНК сегменти. Биологичният смисъл на това свойство става ясен при сравняване на синтеза на ДНК при бактерии и еукариоти. Така че бактериална монорепликонна хромозома с дължина 1600 μm се синтезира със скорост около половин час. Ако сантиметър молекула от хромозомна ДНК на бозайник също се репликира като структура на монорепликон, това ще отнеме около седмица (6 дни). Но ако такава хромозома съдържа няколкостотин репликони, тогава ще отнеме само около час за нейната пълна репликация. Всъщност времето за репликация на ДНК при бозайниците е 6-8 часа. Това е така, защото не всички репликони на отделна хромозома са включени по едно и също време.
В някои случаи се наблюдава едновременно активиране на всички репликони или появата на допълнителни източници на репликация, което прави възможно завършването на синтеза на всички хромозоми в най-кратки срокове. Това явление се среща в ранните етапи на ембриогенезата при някои животни. Така че е известно, че при смачкване на яйца от жаби с нокти Ксенопус laevisСинтезът на ДНК отнема само 20 минути, докато в културата на соматичните клетки този процес продължава около един ден. Подобна картина се наблюдава при Drosophila: в ранните ембрионални стадии целият синтез на ДНК в ядрото отнема 3,5 минути, а в клетките на тъканната култура - 600 минути. В същото време стойността на репликоните в клетките на културата се оказа почти 5 пъти по-голяма, отколкото в ембрионите.
Синтезът на ДНК по дължината на отделна хромозома се извършва неравномерно. Установено е, че в отделна хромозома активните репликони се събират в групи, репликационни единици, които включват 20-80 източника на репликация. Това следва от анализа на ДНК радиоавтографи, където се наблюдава точно такава кохезия на репликиращи се сегменти. Друга причина за идеята за съществуването на блокове или клъстери от репликони или репликационни единици са експериментите с включването на тимидинов аналог 5'-бромодеоксиуридин (BrdU) в ДНК. Включването на BrdU в интерфазния хроматин води до факта, че по време на митоза регионите с BrdU кондензират в по-малка степен (недостатъчна кондензация), отколкото тези региони, където е включен тимидин. Следователно тези области на митотичните хромозоми, в които BrdU е участвал, ще бъдат слабо оцветени при диференциално оцветяване. Това прави възможно определянето на последователността на включване на BrdU върху синхронизирани клетъчни култури; последователността на синтеза на ДНК по дължината на една взета хромозома. Оказа се, че прекурсорът е включен в големи участъци от хромозомата. Включването на различни секции става строго последователно през S-периода. Всяка хромозома се характеризира с висока стабилност на реда на репликация по дължината си, има свой собствен специфичен модел на репликация.
Клъстери от репликони, комбинирани в репликационни единици, са свързани с протеини на ядрената матрица (виж по-долу), които заедно с репликационните ензими образуват т.нар. клъстерозомите са зони в интерфазното ядро, в които се осъществява синтеза на ДНК.
Редът, в който се активират репликационните единици, вероятно може да се определи от структурата на хроматина в тези региони. Например зоните на конститутивния хетерохроматин (близо до центромера) обикновено се репликират в края на S-периода; също така, в края на S-периода, част от факултативния хетерохроматин се удвоява (например Х-хромозомата на женските бозайници ). Особено ясно във времето последователността на репликация на хромозомни региони корелира с модела на диференциално оцветяване на хромозомите: R-сегментите се репликират рано, G-сегментите съответстват на хромозомни региони с късна репликация. С-сегментите (центромерите) са местата на най-новата репликация.
Тъй като размерът и броят на различните групи от различно оцветени сегменти са различни в различните хромозоми, това създава картина на асинхронното начало и край на репликацията на различните хромозоми като цяло. Във всеки случай последователността на началото и края на репликацията на отделните хромозоми в набора не е произволна. Съществува строга последователност на възпроизвеждане на хромозоми спрямо други хромозоми в набора.
Продължителността на процеса на репликация на отделните хромозоми не зависи пряко от техния размер. Така че големите човешки хромозоми от група А (1-3) са белязани през целия S-период, както и по-късите хромозоми от група В (4-5).
По този начин синтезът на ДНК в еукариотния геном започва почти едновременно на всички ядрени хромозоми в началото на S периода. Но в този случай последователното и асинхронно активиране на различни репликони се случва както в различни части на хромозомите, така и в различни хромозоми. Последователността на репликация на една или друга част от генома е строго генетично определена. Това последно твърдение се подкрепя не само от модела на включване на етикети в различни сегменти на S-периода, но и от факта, че има строга последователност на поява по време на S-периода на пикове в чувствителността на определени гени към мутагени .
Химичен съставхромозоми
Физико-химична организация на хромозомите на еукариотните клетки
Изследването на химическата организация на хромозомите на еукариотните клетки показа, че те се състоят главно от ДНК и протеини, които образуват нуклеопротеинов комплекс. хроматин,наречен заради способността си да оцветява с основни багрила.
Както е доказано от множество изследвания (виж § 3.2), ДНК е материален носител на свойствата на наследствеността и променливостта и съдържа биологична информация - програма за развитие на клетка, организъм, написана със специален код. Количеството ДНК в ядрата на клетките на даден организъм от даден вид е постоянно и пропорционално на тяхната плоидност. В диплоидните соматични клетки на тялото той е два пъти повече, отколкото в гаметите. Увеличаване на броя хромозомни наборив полиплоидните клетки е съпроводено с пропорционално нарастване на количеството на ДНК в тях.
Протеините съставляват значителна част от веществото на хромозомите. Те представляват около 65% от масата на тези структури. Всички хромозомни протеини са разделени на две групи: хистони и нехистонови протеини.
Хистонипредставен от пет фракции: HI, H2A, H2B, H3, H4. Като положително заредени основни протеини, те са доста здраво прикрепени към молекулите на ДНК, което предотвратява разчитането на биологичната информация, съдържаща се в тях. Това е тяхната регулаторна роля. В допълнение, тези протеини изпълняват структурна функция, осигурявайки пространствената организация на ДНК в хромозомите (вижте раздел 3.5.2.2).
Брой фракции нехистоновпротеини надхвърля 100. Сред тях са ензими за синтез и обработка на РНК, редупликация и възстановяване на ДНК. Киселинните протеини на хромозомите също играят структурна и регулаторна роля. В допълнение към ДНК и протеини, РНК, липиди, полизахариди и метални йони също се намират в хромозомите.
Хромозомна РНКчастично представени от продукти на транскрипция, които все още не са напуснали мястото на синтеза. Някои фракции имат регулаторна функция.
Регулаторната роля на компонентите на хромозомите е да "забраняват" или "разрешават" отписването на информация от молекулата на ДНК.
Масовите съотношения на ДНК: хистони: нехистонови протеини: РНК: липиди са равни на 1:1:(0,2-0,5):(0,1-0,15):(0,01-0,03). Други компоненти се намират в малки количества.
Докато поддържа приемственост в редица клетъчни поколения, хроматинът променя своята организация в зависимост от периода и фазата на клетъчния цикъл. В интерфазата със светлинна микроскопия се открива под формата на бучки, разпръснати в нуклеоплазмата на ядрото. По време на прехода на клетката към митоза, особено в метафазата, хроматинът приема формата на добре разграничени индивидуални интензивно оцветени тела - хромозоми.
Интерфазните и метафазните форми на съществуване на хроматин се разглеждат като два полярни варианта на неговата структурна организация, свързани в митотичния цикъл чрез взаимни преходи. Тази оценка е подкрепена от данни от електронна микроскопия, че както интерфазните, така и метафазните форми се основават на една и съща елементарна нишковидна структура. В процеса на електронномикроскопични и физикохимични изследвания в състава на интерфазния хроматин и метафазните хромозоми са открити филаменти (фибрили) с диаметър 3,0-5,0, 10, 20-30 nm. Полезно е да запомните, че диаметърът на двойната спирала на ДНК е приблизително 2 nm, диаметърът на нишковидната структура на интерфазния хроматин е 100–200 nm, а диаметърът на една от сестринските хроматиди на метафазната хромозома е 500–600 nm.
Най-разпространената гледна точка е, че хроматинът (хромозомата) е спирална нишка. В същото време се разграничават няколко нива на спирализация (компактизация) на хроматина (Таблица 3.2).
Таблица 3.2. Последователни нива на уплътняване на хроматина
Ориз. 3.46. Нуклеозомна организация на хроматина.
НО -декондензирана форма на хроматин;
Б -електронна микроснимка на еукариотен хроматин:
НО -ДНК молекулата е навита около протеиновите ядра;
Б -хроматинът е изграден от нуклеозоми, свързани с линкерна ДНК
Нуклеозомна нишка.Това ниво на организация на хроматина се осигурява от четири вида нуклеозомни хистони: H2A, H2B, H3, H4. Те образуват протеинови тела с форма на шайба - кора,състоящ се от осем молекули (по две молекули от всеки тип хистон) (фиг. 3.46).
Молекулата на ДНК е завършена с протеинови ядра, спирално увиващи се около тях. В този случай ДНК сегмент, състоящ се от 146 базови двойки (bp), е в контакт с всяко ядро. ДНК сегменти, свободни от контакт с протеинови тела, се наричат свързващи веществаили линкер.Те включват от 15 до 100 bp. (средно 60 bp) в зависимост от типа клетка.
Сегмент от ДНК молекула с дължина около 200 bp. заедно с протеиновото ядро е нуклеозома.Благодарение на тази организация структурата на хроматина се основава на нишка, която е верига от повтарящи се единици - нуклеозоми (фиг. 3.46, б). В това отношение човешкият геном, състоящ се от 3 × 10 9 bp, е представен от двойна спирала на ДНК, опакована в 1,5 × 10 7 нуклеозоми.
По дължината на нуклеозомната верига, която наподобява верига от мъниста, има участъци от ДНК, свободни от протеинови тела. Тези региони, разположени на интервали от няколко хиляди базови двойки, играят важна роля в по-нататъшното опаковане на хроматина, тъй като съдържат нуклеотидни последователности, които се разпознават специфично от различни нехистонови протеини.
В резултат на нуклеозомната организация на хроматина, двойната спирала на ДНК с диаметър 2 nm придобива диаметър 10-11 nm.
Хроматинови фибрили.По-нататъшното уплътняване на нуклеозомната верига се осигурява от буталото HI, което чрез свързване с линкерната ДНК и две съседни протеинови тела ги приближава едно до друго. В резултат на това се образува по-компактна структура, изградена вероятно като соленоид. Този хроматинов фибрил, наричан още елементарен,има диаметър 20-30 nm (фиг. 3.47).
Интерфазна хромонема.Следващото ниво на структурна организация на генетичния материал се дължи на сгъването на хроматиновите фибрили в бримки. Очевидно в тяхното образуване участват нехистонови протеини, които са способни да разпознават специфични нуклеотидни последователности на екстрануклеозомна ДНК, разделени една от друга с няколко хиляди базови двойки. Тези протеини обединяват посочените области с образуването на бримки от фрагментите на хроматиновия фибрил, разположен между тях (фиг. 3.48). Участъкът от ДНК, съответстващ на една бримка, съдържа от 20 000 до 80 000 bp. Може би всяка бримка е функционална единица на генома. В резултат на такова опаковане хроматинова фибрила с диаметър 20-30 nm се трансформира в структура с диаметър 100-200 nm, т.нар. интерфазна хромонема.
Отделни области на интерфазна хромонема претърпяват допълнително уплътняване, образувайки се структурни блокове,обединяване на съседни контури със същата организация (фиг. 3.49). Те се намират в интерфазното ядро под формата на бучки хроматин. Възможно е съществуването на такива структурни блокове да определя модела на неравномерно разпределение на някои багрила в метафазните хромозоми, който се използва в цитогенетичните изследвания (виж раздели 3.5.2.3 и 6.4.3.6).
Нееднаквата степен на уплътняване на различните части на интерфазните хромозоми е голяма функционална стойност. В зависимост от състоянието на хроматина има еухроматиченучастъци от хромозоми, които са по-малко плътно опаковани в неделящи се клетки и потенциално се транскрибират, и хетерохроматиченобласти, характеризиращи се с компактна организация и генетична инертност. В техните граници не се извършва транскрипция на биологична информация.
Има конститутивен (структурен) и факултативен хетерохроматин.
конститутивенхетерохроматинът се намира в перицентромерните и теломерните области на всички хромозоми, както и в някои вътрешни фрагменти на отделни хромозоми (фиг. 3.50). Образува се само от нетранскрибирана ДНК. Вероятно неговата роля е да поддържа цялостната структура на ядрото, да прикрепя хроматина към ядрената обвивка, взаимното разпознаване на хомоложни хромозоми по време на мейозата, разделянето на съседни структурни гени и участието в регулирането на тяхната активност.
Ориз. 3.49. Структурни блокове в организацията на хроматина.
НО -примкова структура на хроматина;
Б -по-нататъшна кондензация на хроматиновите бримки;
В -свързване на бримки с подобна структура в блокове с образуването на крайната форма на интерфазната хромозома
Ориз. 3.50. Конститутивен хетерохроматин в човешки метафазни хромозоми
Пример по желаниехетерохроматинът служи като тяло на половия хроматин, който обикновено се образува в клетките на организми с хомогаметичен пол (при хората женският пол е хомогаметичен) на една от двете Х хромозоми. Гените на тази хромозома не се транскрибират. Образуването на факултативен хетерохроматин за сметка на генетичния материал на други хромозоми придружава процеса на клетъчна диференциация и служи като механизъм за изключване на активната функция на групи гени, чиято транскрипция не се изисква в клетки с дадена специализация. В тази връзка моделът на хроматина на клетъчните ядра от различни тъкани и органи върху хистологичните препарати варира. Пример за това е хетерохроматизацията на хроматина в ядрата на зрелите птичи еритроцити.
Изброените нива на структурна организация на хроматина се намират в неделяща се клетка, когато хромозомите все още не са достатъчно уплътнени, за да бъдат видими в светлинен микроскоп като отделни структури. Само някои от техните области с по-висока плътност на опаковката се откриват в ядрата под формата на хроматинови бучки (фиг. 3.51).
Ориз. 3.51. Хетерохроматин в интерфазното ядро
Компактни петна от хетерохроматин, групирани около ядрото и ядрената мембрана
метафазна хромозома.Навлизането на клетка от интерфаза в митоза е придружено от суперкомпактизация на хроматина. Индивидуалните хромозоми стават ясно различими. Този процес започва в профаза, достигайки максималната си експресия в метафазата на митозата и анафазата (виж раздел 2.4.2). В телофазата на митозата настъпва декомпактизация на хромозомното вещество, което придобива структурата на интерфазен хроматин. Описаната митотична суперкомпактизация улеснява разпределението на хромозомите към полюсите на митотичното вретено в анафазата на митозата. Степента на уплътняване на хроматина в различни периоди от митотичния цикъл на клетката може да се оцени от данните, дадени в таблица 1. 3.2.