Όμορφα σχέδια στα κελιά.

Στη μικροσκοπία μεταδιδόμενου φωτός, η ποιότητα του δείγματος δεν διευκολύνει πάντα την παρατήρηση και την εγγραφή εικόνων με εξαιρετική αντίθεση στη λειτουργία απεικόνισης απλού φωτεινού πεδίου. Οι μελέτες που επικεντρώνονται σε δείγματα εγγενώς χαμηλής αντίθεσης, όπως μη χρωματισμένα βακτήρια, λεπτές τομές ιστού και προσκολλημένα ζωντανά κύτταρα βασίζονται σε εξειδικευμένες τεχνικές ενίσχυσης της αντίθεσης για να βοηθήσουν στην οπτικοποίηση αυτών των ουσιαστικά διαφανών δειγμάτων. Κατά την εξέταση δειγμάτων που δεν έχουν χρωματιστεί, η κακή απορρόφηση φωτός από το δείγμα οδηγεί σε εξαιρετικά μικρές αλλαγές στη διαφορά κατανομής της έντασης μεταξύ του δείγματος και του φόντου.

Όταν το φόντο είναι φωτεινό, το ανθρώπινο μάτι απαιτεί τοπικές διακυμάνσεις της έντασης τουλάχιστον 10-20% για να μπορεί να αναγνωρίσει τις λεπτομέρειες του δείγματος. Δυστυχώς, αυτό το επίπεδο διαμόρφωσης σπάνια παρατηρείται με διαφανή δείγματα, τα οποία είναι συνήθως σχεδόν αόρατα σε ένα φόντο αυτής της έντασης. Ο όρος μεταδιδόμενο φως, όταν χρησιμοποιείται στην οπτική μικροσκοπία, αναφέρεται σε οποιαδήποτε τεχνική απεικόνισης όπου το φως μεταδίδεται από μια πηγή φωτισμού στην αντίθετη πλευρά του δείγματος σε ένα αντικείμενο.

Οι τεχνικές βελτίωσης της αντίθεσης που περιγράφονται σε αυτήν την ενότητα είναι μια ποικιλία μεθόδων προετοιμασίας δειγμάτων καθώς και οπτικά κόλπα που δημιουργούν αλλαγές έντασης που είναι χρήσιμες για παρατήρηση και απεικόνιση. Οι τεχνικές που ενισχύουν την αντίθεση περιλαμβάνουν την αντίθεση διαφορικής παρεμβολής, το πολωμένο φως, την αντίθεση φάσης, την αντίθεση διαμόρφωσης Hoffman και τη σκοτεινή μικροσκοπία. Ορισμένες από αυτές τις τεχνικές περιορίζονται στο φως που προέρχεται από περιοχές μακριά από το εστιακό επίπεδο κατά την απεικόνιση παχύτερων φυτικών και ζωικών ιστών, ενώ το πολωμένο φως απαιτεί διπλή διάθλαση για να δημιουργήσει αντίθεση.

Η απεικόνιση στο ΣΧ. 1 είναι διάφορες δημοφιλείς μέθοδοι ενίσχυσης της αντίθεσης που χρησιμοποιούνται συνήθως σε τεχνικές διάχυτου φωτός. Στη λεπτή τομή του ιστού στο Σχ. 1 δείχνει ένα ανθρώπινο βασικοκυτταρικό καρκίνωμα χρωματισμένο με ηωσίνη και αιματοξυλίνη για χρωματική αντίθεση σε λειτουργία απεικόνισης υψηλού πεδίου. Μια σταθερή καλλιέργεια κυττάρων ινδικού Muntaca τοποθετημένα σε υδάτινο περιβάλλον παρουσιάζεται στην εικόνα αντίθεσης στο Σχήμα 1. Μία από τις κύριες και αγαπημένες τεχνικές που χρησιμοποιήθηκαν σε όλες τις μορφές οπτικής μικροσκοπίας τους τελευταίους τρεις αιώνες, ο έντονος φωτισμός βασίζεται στις αλλαγές στο φως απορρόφηση, δείκτη διάθλασης ή χρώμα για τη δημιουργία αντίθεσης.

Η ανάλυση σε ένα φωτεινό σύστημα εξαρτάται τόσο από τα αριθμητικά ανοίγματα του αντικειμενικού όσο και του συμπυκνωτή και απαιτείται ένα μέσο εμβάπτισης και στις δύο πλευρές του δείγματος. Οι ψηφιακές φωτογραφικές μηχανές παρέχουν το ευρύ δυναμικό εύρος και τη χωρική ανάλυση που απαιτούνται για την καταγραφή των πληροφοριών που υπάρχουν σε μια φωτεινή εικόνα. Επιπλέον, οι αλγόριθμοι αφαίρεσης φόντου, χρησιμοποιώντας μέσα πλαίσια που λαμβάνονται χωρίς δείγμα στην οπτική διαδρομή, αυξάνουν δραματικά την αντίθεση.

Η απλή φωτεινή απεικόνιση με τη σωστή ρύθμιση μικροσκοπίου για φωτισμό Koehler παρέχει περιορισμένες πληροφορίες σχετικά με το περίγραμμα του κυττάρου, τη θέση του πυρήνα και τη θέση των μεγάλων φυσαλίδων σε μη χρωματισμένα δείγματα. Η αντίθεση σε μια φωτεινή εικόνα εξαρτάται από τις διαφορές στην απορρόφηση φωτός, στον δείκτη διάθλασης ή στο χρώμα. Οι οπτικές διαφορές αναπτύσσονται καθώς το φως περνά μέσα από το δείγμα, αλλάζοντας την κατεύθυνση, την ταχύτητα ή τα φασματικά χαρακτηριστικά του μετώπου κύματος της εικόνας. Ωστόσο, η γενική έλλειψη αντίθεσης στη λειτουργία φωτεινού πεδίου στη μελέτη μη χρωματισμένων δειγμάτων καθιστά αυτή τη μέθοδο σχετικά άχρηστη για σοβαρές μελέτες της δομής των ζωντανών κυττάρων.

Αυτή η μέθοδος είναι ιδανική για λεπτά, μη χρωματισμένα δείγματα που βρίσκονται περίπου 5-10 μm πάνω από τον πυρήνα, αλλά λιγότερο από ένα μικρόμετρο πάχους στην περιφέρεια. Τέτοια δείγματα μετά βίας δείχνουν απορρόφηση φωτός στο ορατό μέρος του φάσματος και το ανθρώπινο μάτι δεν μπορεί να τα εντοπίσει σε έντονο φως και σκοτεινό φως. Το μικροσκόπιο πρέπει να είναι εξοπλισμένο με ειδικό συμπυκνωτή που να περιέχει έναν δακτυλιοειδή χώρο ή μια σειρά δακτυλίων που να ταιριάζουν με ένα σύνολο στόχων που περιέχουν δακτυλίους φάσης στο πίσω εστιακό επίπεδο. Η αντίθεση φάσης είναι ένας πολύ καλός τρόπος για να αυξήσετε την αντίθεση κατά την προβολή ή την απεικόνιση ζωντανών κυττάρων σε καλλιέργεια, αλλά συνήθως οδηγεί σε φωτοστέφανα που περιβάλλουν το περίγραμμα των ακραίων χαρακτηριστικών.

Αυτά τα φωτοστέφανα είναι οπτικά τεχνουργήματα που συχνά μειώνουν την ορατότητα της λεπτομέρειας των άκρων. Η μέθοδος δεν είναι χρήσιμη για παχιά δείγματα, επειδή οι μετατοπίσεις φάσης συμβαίνουν σε περιοχές μακριά από το εστιακό επίπεδο, οι οποίες παραμορφώνουν τις λεπτομέρειες της εικόνας. Επιπλέον, τα αιωρούμενα συντρίμμια και άλλα αντικείμενα φάσης εκτός εστίασης παρεμβαίνουν στο σχηματισμό κολλωδών εικόνων κυττάρων σε καλυπτρίδες.

Η αντίθεση φάσης κάνει αυτές τις μικροσκοπικές διαφορές ορατές μέσω οπτικού χειρισμού, καθώς τις μεταφράζει, για παράδειγμα, σε διαφορές στην ένταση που μπορούν να παρατηρηθούν και να καταγραφούν οπτικά. Το οπτικό αποτέλεσμα που χρησιμοποιείται σε αυτή την περίπτωση συνίσταται σε μια μετατόπιση των σχέσεων φάσης μεταξύ των μετώπων κύματος φωτός που διέρχονται από διαφορετικά μέρη του δείγματος. Κατά τη διάρκεια του ταξιδιού τους μέσα από τους πυρήνες των κυττάρων, το κυτταρόπλασμα ή το νερό, τα κύματα φωτός μετατοπίζονται κατά μικρές μοίρες, καθώς αυτά τα μέσα έχουν ελαφρώς διαφορετικούς δείκτες διάθλασης.

Το ποσό της καθυστέρησης ονομάζεται μετατόπιση φάσης. Πριν εισέλθουν στο δείγμα, τα κύματα είναι ακόμα σε φάση, αλλά αυτό δεν ισχύει πλέον όταν έχουν περάσει από διαφορετικά υλικά με διαφορετικούς δείκτες διάθλασης. Το μέγεθος της μετατόπισης φάσης εξαρτάται από τα μέσα που έχουν περάσει τα κύματα κατά μήκος των μονοπατιών τους και πόσο καιρό έχουν περάσει τα μονοπάτια μέσα από αυτά τα μέσα. Το ανθρώπινο μάτι δεν μπορεί να δει αυτές τις μετατοπίσεις φάσης στην εικόνα του μικροσκοπίου, είναι σε θέση να διακρίνει διαφορετικές εντάσεις και χρώματα. Επομένως, η μέθοδος αντίθεσης φάσης χρησιμοποιεί οπτικά κόλπα για να μεταφράσει τις μετατοπίσεις φάσης σε τιμές γκρι.

Σε μια διαμόρφωση μικροσκοπίου αντίθεσης φάσης, το διάφραγμα του ανοίγματος του συμπυκνωτή αντικαθίσταται από ένα στοπ φάσης που φωτίζει το δείγμα μέσω των οπτικών στοιχείων του συμπυκνωτή σε έναν κοίλο κώνο φωτός όπως φαίνεται στο Σχήμα 3. Αυτά τα μέτωπα κύματος εισέρχονται στον αντικειμενικό στόχο και στην εικόνα Διακοπής Φάσης δημιουργείται στο πίσω εστιακό επίπεδο. Τοποθετημένο στον φακό, το πίσω εστιακό επίπεδο είναι ένας δακτύλιος φάσης ή πλάκα που όχι μόνο εξασθενεί το έντονο άμεσο φως που προκύπτει από τη διακοπή φάσης στον συμπυκνωτή, αλλά προσθέτει επίσης μια μόνιμη μετατόπιση φάσης σε αυτό το φως.

Τα μέτωπα κύματος που διαθλώνται από το δείγμα δεν θα περάσουν από τον δακτύλιο φάσης στον αντικειμενικό φακό, πράγμα που σημαίνει ότι δεν θα εξασθενήσουν ή θα επιβραδυνθούν. Όλα τα μέτωπα κύματος ανασυνδυάζονται τελικά για να σχηματίσουν μια ενδιάμεση εικόνα χρησιμοποιώντας έναν σωληνωτό φακό.

Μέτωπα κύματος, τα οποία έχουν δει όλα ποικίλους βαθμούςΟι λεπτομέρειες του δείγματος υπερτίθενται ως ενδιάμεση εικόνα στα μετατοπισμένα και εξασθενημένα μέτωπα κύματος, όπου ενισχύονται ή εξασθενούν το ένα το άλλο, σχηματίζοντας την εικόνα αντίθεσης τελικής φάσης που παρατηρείται στους προσοφθάλμιους φακούς. Αυτές οι διαδικασίες παρεμβολής στην ενδιάμεση εικόνα δημιουργούν φωτεινές και σκοτεινές περιοχές διαφορετικών δομών με αλλαγές στον δείκτη διάθλασης στο δείγμα. Η βέλτιστη αντίθεση δημιουργείται με την επιλογή των σωστών τιμών καθυστέρησης και εξασθένησης, η οποία είναι συνάρτηση των οπτικών ιδιοτήτων του δακτυλίου φάσης στο άνοιγμα του αντικειμενικού ανοίγματος.

Το κύριο τεχνούργημα απεικόνισης αντίθεσης φάσης είναι το φωτεινό φωτοστέφανο που εμφανίζεται στις άκρες που περιβάλλουν το δείγμα. Τα αλογονίδια βρίσκονται σε μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, επειδή ο κυκλικός δακτύλιος φάσης ινών που βρίσκεται στην αντικειμενική φάση μεταδίδει επίσης μια μικρή ποσότητα περιθλαμένου φωτός από το δείγμα. Το πρόβλημα επιδεινώνεται από το γεγονός ότι το πλάτος του μετώπου κύματος μη διαθλασμένου όγκου φωτός που προβάλλεται στην πλάκα φάσης από το διάκενο του πυκνωτή είναι μικρότερο από το πραγματικό πλάτος του δακτυλίου της πλάκας φάσης.

Τα παχιά δείγματα, που συχνά επιδεικνύουν πολύ επικαλυπτόμενες δομές, παράγουν βαριά τεχνουργήματα φωτοστέφανου. Επομένως, η αντίθεση φάσης είναι μια τεχνική που συνιστάται μόνο για πολύ λεπτά δείγματα όπου πολλές δομές δεν βρίσκονται φυσικά η μία πάνω στην άλλη. Σε ένα παχύ μοτίβο, οι λεπτομέρειες μπορούν να αναμειχθούν στην εικόνα, η οποία τελικά δεν είναι πλέον ευανάγνωστη.

Η αντίθεση φάσης απαιτεί ειδικούς στόχους που είναι εξοπλισμένοι με δακτύλιο φάσης κοντά στην κόρη ή στο οπίσθιο άνοιγμα. Ο πυκνωτής απαιτεί μία, δύο ή τρεις στάσεις φάσης ανάλογα με τους στόχους αντίθεσης φάσης που είναι προσαρτημένοι στο άκρο του μικροσκοπίου. Εάν χρησιμοποιείτε αντίθεση φάσης με ένα μόνο μέγεθος δακτυλίου, είναι αρκετά εύκολο να εγκαταστήσετε και να αφαιρέσετε το αφαιρούμενο βύσμα πυκνωτή. Ένας πυργίσκος με πολλαπλές βάσεις είναι πιο βολικός καθώς περιέχει και τα τρία στοπ φάσης και επιτρέπει πολύ γρήγορη εναλλαγή κατά τη διάρκεια της απόδοσης.

Διατίθενται πρόσθετα ανοίγματα για την ίριδα που απαιτείται σε έντονο φως και για τη σκοτεινή ίριδα.


Το κεντράρισμα γίνεται με δύο μικρά κλειδιά στον πυργίσκο συμπυκνωτή. Εάν θέλετε να είστε ιδιαίτερα ακριβείς, χρησιμοποιήστε ένα τηλεσκόπιο κεντραρίσματος για να παρατηρήσετε το αντικειμενικό πίσω διάφραγμα για να κάνετε αυτές τις ρυθμίσεις, όπως φαίνεται στο σχήμα. Αυτό το μικρό αξεσουάρ μοιάζει με προσοφθάλμιο προσοφθάλμιο και εισάγεται σε ένα οπτικό σωλήνα αντί για προσοφθάλμιο. Όταν το τηλεσκόπιο εστιάζει στην κόρη του αντικειμενικού φακού, η θέση των στάσεων φάσης μπορεί να παρατηρηθεί καθαρά.

Και πάλι, κοιτάξτε στην αντικειμενική κόρη και φέρτε τη φωτεινή εικόνα της φάσης του πυκνωτή σε ευθυγράμμιση με τον δακτύλιο φάσης του αντικειμενικού φακού. Αυτό φαίνεται ξεκάθαρα στα Σχήματα 4 και 4, το στοπ φάσης δεν είναι ευθυγραμμισμένο με τη φάση του φακού, ενώ το στοπ και η πλάκα φάσης βρίσκονται σε τέλεια συμφωνία στο Σχήμα 4.

Η εικόνα ενός δείγματος σε αντίθεση φάσης μπορεί να επηρεαστεί από τη σωστή επιλογή της επιβράδυνσης της εμπρόσθιας δέσμης με προσεκτική επιλογή του δακτυλίου φάσης στον αντικειμενικό φακό. Ανάλογα με την επιλεγμένη τιμή καθυστέρησης, τα αντικείμενα με υψηλότερο δείκτη διάθλασης από το περιβάλλον τους εμφανίζονται φωτεινότερα ή πιο σκοτεινά από το περιβάλλον τους. περιβάλλον. Αυτό ονομάζεται επίσης θετική ή αρνητική αντίθεση φάσης. Στα σύγχρονα μικροσκόπια, η αντίθεση θετικής φάσης είναι στάνταρ, όπου το σκοτάδι των αντικειμένων αυξάνεται με τον δείκτη διάθλασής τους.