μέθοδος αντίθεσης φάσης. Μέθοδοι μικροσκοπίας (φθορισμού, σκοτεινού πεδίου, αντίθεσης φάσης, ηλεκτρονίων). Αλληλεπίδραση κυμάτων φωτός με μοτίβα φάσεων
Το ανθρώπινο μάτι διακρίνει μόνο το μήκος (χρώμα) και το πλάτος (ένταση, αντίθεση) ενός φωτεινού κύματος, αλλά δεν ανιχνεύει διαφορές στη φάση. Σχεδόν όλα τα ζωντανά κύτταρα είναι διαφανή, αφού οι ακτίνες φωτός που διέρχονται από αυτά δεν αλλάζουν το πλάτος τους, αν και αλλάζουν σε φάση. Είναι δυνατό να μετατραπεί ένα παρασκεύασμα «φάσης» (χωρίς αντίθεση) σε παρασκεύασμα «πλάτους» (αντίθεσης) είτε με χρώση του αντικειμένου (αυτή η μέθοδος είναι ελάχιστα χρήσιμη για ζωντανά κύτταρα) είτε μειώνοντας το άνοιγμα του συμπυκνωτή καλύπτοντας το διάφραγμα (αυτή η μέθοδος είναι επίσης ανεπιθύμητη, καθώς μειώνει την ανάλυση του μικροσκοπίου).
Η μέθοδος μικροσκοπίας αντίθεσης φάσης αναπτύχθηκε για την παρατήρηση διαφανών αντικειμένων· βασίζεται στον μετασχηματισμό των αλλαγών φάσης που υφίστανται ένα κύμα φωτός όταν διέρχεται από ένα αντικείμενο σε ορατό πλάτος χρησιμοποιώντας μια συγκεκριμένη οπτική συσκευή. Εάν ένας ειδικός δίσκος είναι τοποθετημένος στο φακό ενός συμβατικού μικροσκοπίου - μια πλάκα φάσης με δακτύλιο (που λαμβάνεται με ψεκασμό του δίσκου με άλατα σπάνιων μετάλλων πάχους μερικών δέκατων του μικρομέτρου) και ένα δακτυλιοειδές διάφραγμα (πλάκα αδιαπέραστη στο φως ακτίνες με μια διαφανή σχισμή με τη μορφή δακτυλίου) - στον συμπυκνωτή, έτσι ώστε μόνο ένας δακτύλιος φωτός πέρασε μέσα από τον συμπυκνωτή και τον φακό, ο οποίος στη συνέχεια συμπίπτει με τον δακτύλιο της πλάκας φάσης του φακού και στη συνέχεια οι φάσεις του η μετατόπιση της δέσμης του διερχόμενου φωτός (συνήθως κατά 1/4 του μήκους κύματος), οι αλλαγές φάσης μετατρέπονται σε πλάτος και το φάρμακο γίνεται αντίθεση.
Για τη διεξαγωγή έρευνας, είναι απαραίτητο, εκτός από ένα μικροσκόπιο φωτός, να υπάρχει μια συσκευή αντίθεσης φάσης (το πιο ευρέως χρησιμοποιούμενο μοντέλο είναι το KF-4), η οποία αποτελείται από στόχους φάσης (υπάρχει το γράμμα "F" στο πλαίσιο ), συμπυκνωτές με ένα σετ δακτυλιοειδών διαφραγμάτων και ένα βοηθητικό μικροσκόπιο (μια οπτική συσκευή που τοποθετείται στο σωλήνα αντί του προσοφθάλμιου φακού κατά τη ρύθμιση της αντίθεσης φάσης).
Η μέθοδος χρησιμοποιείται για τη μελέτη ζωντανών κυττάρων μικροοργανισμών, η αντίθεση των οποίων επιτυγχάνεται οπτικά χωρίς να παρεμβαίνει στις φυσιολογικές διεργασίες των υπό μελέτη αντικειμένων.
1. Πότε χρησιμοποιείται το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης;
2. Σε τι βασίζεται η μέθοδος της μικροσκοπίας αντίθεσης φάσης;
3. Ποια είναι η διαφορά μεταξύ του σχεδιασμού ενός μικροσκοπίου αντίθεσης φάσης και ενός συμβατικού μικροσκοπίου φωτός;
4. Πώς είναι διατεταγμένο το μοντέλο αντίθεσης φάσης KF-4;
Φωτεινής, ή φθορισμού, μικροσκοπία
Ορισμένα βιολογικά αντικείμενα είναι ικανά, όταν φωτίζονται με ακτίνες μικρού μήκους κύματος (μπλε-ιώδες, υπεριώδες), να τα απορροφούν και να εκπέμπουν ακτίνες με μεγαλύτερο μήκος κύματος. Σε αυτή την περίπτωση, τα κύτταρα θα φαίνονται να λάμπουν με ένα κιτρινοπράσινο ή πορτοκαλί φως. Αυτό το λεγόμενο δική, ή πρωταρχική, φωταύγεια.
Αντικείμενα που δεν φωσφορίζουν μπορούν να υποβληθούν σε επεξεργασία με ειδικά φθοροχρωματικά (κίτρινο ακριδίνης, πορτοκαλί ακριδίνης, αουραμίνη, πριμουλίνη, θειοφλαβίνη, κόκκινο του Κονγκό, τετρακυκλίνη, κινίνη) και επίσης να παρατηρήσουν φωταύγεια.
Θα είναι ήδη που προκαλείται,ή δευτερεύουσα, φωταύγεια.
Παρασκευάσματα που βάφονται με φθοριόχρωμα μελετώνται σε μέσα που δεν φωτίζουν υπό τη δράση ακτίνων μικρού μήκους κύματος: σε νερό, γλυκερίνη, έλαιο βαζελίνης ή αλατούχο ορό.
Το οπτικό σχήμα ενός μικροσκοπίου φθορισμού διαφέρει από μια συμβατική πηγή φωτός (μπορείτε να χρησιμοποιήσετε μια λάμπα υδραργύρου και εάν είναι δυνατόν να διεγείρετε τη φωταύγεια ενός αντικειμένου με μπλε-ιώδεις ακτίνες, τότε λαμπτήρες χαμηλής τάσης) και την παρουσία δύο φίλτρα φωτός στη διαδρομή των ακτίνων: ένα φίλτρο μπλε φωτός μπροστά από τον συμπυκνωτή που μεταδίδει τις μπλε-ιώδεις ακτίνες του ορατού φάσματος και ένα φίλτρο κίτρινου φωτός - στο προσοφθάλμιο του μικροσκοπίου, το οποίο αφαιρεί τις μπλε ακτίνες που παρεμβαίνουν στο ανίχνευση φωταύγειας.
Το μικροσκόπιο φθορισμού, σε σύγκριση με το συμβατικό μικροσκόπιο, σας επιτρέπει να συνδυάσετε μια έγχρωμη εικόνα και την αντίθεση των αντικειμένων. μελέτη της μορφολογίας ζωντανών και νεκρών κυττάρων μικροοργανισμών σε θρεπτικά μέσα και ιστούς ζώων και φυτών· να μελετήσει κυτταρικές μικροδομές που απορροφούν επιλεκτικά διάφορα φθοριόχρωμα, τα οποία, στην περίπτωση αυτή, είναι, όπως λέγαμε, συγκεκριμένοι κυτταροχημικοί δείκτες. να προσδιορίσει τις λειτουργικές και μορφολογικές αλλαγές στα κύτταρα. χρήση φθοριοχρωμάτων σε ανοσολογικές αντιδράσεις και καταμέτρηση βακτηρίων σε δείγματα με χαμηλή περιεκτικότητα σε αυτά.
ηλεκτρονική μικροσκοπία
Σύμφωνα με το δομικό σχήμα, ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο είναι παρόμοιο με ένα μικροσκόπιο φωτός, αλλά το αντικείμενο δεν φωτίζεται από μια δέσμη φωτός, αλλά από ένα ρεύμα ηλεκτρονίων από ένα νήμα βολφραμίου που θερμαίνεται από ηλεκτρικό ρεύμα.
Η ανάλυση των σύγχρονων ηλεκτρονικών μικροσκοπίων είναι 0,2-0,4 nm, η μεγέθυνση εργασίας είναι κατά μέσο όρο 100.000 φορές.
Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο μετάδοσης.
Το μικροσκόπιο μετάδοσης (μετάδοση, διέλευση ηλεκτρονίων μέσω του αντικειμένου) χρησιμοποιείται ευρέως στη βιολογική έρευνα.
Κάθε ηλεκτρονικό μικροσκόπιο αποτελείται από ένα όπλο ηλεκτρονίων (πηγή ηλεκτρονίων). ηλεκτρομαγνητικά πηνία που λειτουργούν ως φακοί συμπυκνωτή, αντικειμενικού φακού και προβολής στο στάδιο του αντικειμένου. οθόνη εικόνας και προσοφθάλμιο. Το μικροσκόπιο απαιτεί αντλία κενού για να λειτουργήσει. Τα ηλεκτρόνια μπορούν να κινηθούν μόνο στο κενό. Τα ηλεκτρόνια σε ένα μικροσκόπιο μετάδοσης ακολουθούν την ίδια διαδρομή με τις ακτίνες φωτός σε ένα μικροσκόπιο φωτός.
Μια εικόνα ενός αντικειμένου μπορεί να φωτογραφηθεί εάν η φθορίζουσα οθόνη (μια μεταλλική πλάκα επικαλυμμένη με ένα λεπτό στρώμα θειούχου ψευδαργύρου ή θειούχου ψευδαργύρου με σεληνιούχο κάδμιο) αντικατασταθεί με μια φωτογραφική πλάκα.
Παρασκευάσματα για ηλεκτρονικές μικροσκοπικές μελέτες τοποθετούνται σε ειδικά πλέγματα, στα οποία εφαρμόζεται το λεπτότερο φιλμ (υπόστρωμα). Το συνολικό πάχος του παρασκευάσματος και του υποστρώματος δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,25 μm.
Κατά τη μελέτη των μορφολογικών χαρακτηριστικών κυττάρων μικροοργανισμών κάτω από ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, μελετώνται ολόκληρα κύτταρα και οι τομές τους, το πάχος των οποίων δεν πρέπει να υπερβαίνει τα 0,8-0,9 μικρά.
Η αντίθεση του αντικειμένου εξασφαλίζεται με ψεκασμό του αντικειμένου με βαρέα μέταλλα (χρώμιο, χρυσό, παλλάδιο) ή με επεξεργασία του με σκιαγραφικά μέσα όπως φωσφοβολφραμικό οξύ και οξικό ουρανύλιο.
Ηλεκτρονικό μικροσκόπιο σάρωσης ή σάρωσης.Δίνει μια τρισδιάστατη, σχεδόν τρισδιάστατη εικόνα του υπό μελέτη αντικειμένου. Στα μικροσκόπια σάρωσης, μια κινητή λεπτή δέσμη ηλεκτρονίων πολύ γρήγορα και σταθερά τρέχει γύρω από την επιφάνεια του υπό μελέτη δείγματος κατά μήκος ενός τετράγωνου ράστερ και μεταδίδει τις πληροφορίες που λαμβάνονται σε έναν καθοδικό σωλήνα επικαλυμμένο με φώσφορο που λάμπει υπό τη δράση ηλεκτρονίων.
Το βάθος εστίασης ενός μικροσκοπίου σάρωσης φτάνει αρκετά χιλιοστά. τα όρια χρήσιμης μεγέθυνσης είναι 10-50 χιλιάδες φορές, η ανάλυση είναι μικρότερη από αυτή των μετάδοσης.
Τα σκευάσματα για μικροσκόπια σάρωσης υποβάλλονται σε ειδική επεξεργασία, ο κύριος σκοπός της οποίας είναι η αφυδάτωση του αντικειμένου χωρίς να διαταραχθεί (τσαλακωθεί) η επιφάνεια των κατασκευών. Στη συνέχεια, το δείγμα επικαλύπτεται με ένα λεπτό στρώμα χρυσού ή κράματος πλατίνας, το οποίο καθιστά την επιφάνεια του δείγματος ηλεκτρικά αγώγιμη και αποφεύγει τη συσσώρευση ηλεκτρικού φορτίου, το οποίο μπορεί να μειώσει την ανάλυση του μικροσκοπίου.
Όταν εργάζεστε με ηλεκτρονικό μικροσκόπιο, πρέπει να ακολουθείτε αυστηρά τους κανόνες ασφαλείας.
Ασκηση:
Σχεδιάστε ένα διάγραμμα της συσκευής ενός ηλεκτρονικού μικροσκοπίου, χρησιμοποιώντας το Σχ. 2 από το έγχρωμο φυλλάδιο.
Ερωτήσεις τεστ:
1. Ποια είναι τα πλεονεκτήματα της μικροσκοπίας φθορισμού, σε τι βασίζεται;
2. Τι σημαίνει πρωτογενής φωταύγεια;
3. Πώς μπορεί να επιτευχθεί επαγόμενη ή δευτερογενής φωταύγεια;
4. Ποια είναι η ανάλυση και η λειτουργική μεγέθυνση των σύγχρονων ηλεκτρονικών μικροσκοπίων;
5. Σε ποιο φυσικό φαινόμενο βασίζεται η ηλεκτρονική μικροσκοπία;
6. Να αναφέρετε δύο είδη ηλεκτρονικών μικροσκοπίων.
7. Από ποια στοιχεία αποτελείται ένα ηλεκτρονικό μικροσκόπιο;
8. Ποια είναι τα χαρακτηριστικά της προετοιμασίας του δείγματος σε ένα μικροσκόπιο μετάδοσης;
9. Ποια είναι τα πλεονεκτήματα της μικροσκοπίας σάρωσης ή σάρωσης;
10. Πώς προετοιμάζονται οι πλάκες μικροσκοπίου σάρωσης;
Το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης αυξάνει σημαντικά την αντίθεση αντικειμένων που είναι διαφανή στο φως και χρησιμοποιείται στην ιατρική για τη μελέτη φυσικών παρασκευασμάτων. Με τη βοήθεια αυτής της μεθόδου, άχρωμα, διαφανή αντικείμενα, λεπτομέρειες, η δομή των οποίων οπτικά διαφέρει ελάχιστα μεταξύ τους, μπορούν να διερευνηθούν χωρίς προεπεξεργασία.
Τα έγχρωμα παρασκευάσματα απορροφούν μερικώς το φως. Μια δέσμη φωτός που διέρχεται από ένα τέτοιο παρασκεύασμα χάνει την έντασή της, δηλ. το πλάτος του φωτεινού κύματος μειώνεται και αυτό γίνεται εύκολα αντιληπτό από το μάτι του ερευνητή. Τέτοια παρασκευάσματα είναι αντίθεση ακόμη και σε ένα συμβατικό μικροσκόπιο και ονομάζονται "πλάτος". Τα παρασκευάσματα που δεν απορροφούν φως είναι διαφανή. Μια δέσμη φωτός που περνά μέσα από ένα τέτοιο παρασκεύασμα δεν χάνει την έντασή της. Το πλάτος του φωτεινού κύματος δεν αλλάζει, αλλά αλλάζει μόνο η φάση της ταλάντωσης, η οποία δεν καταγράφεται από το ανθρώπινο μάτι. Τέτοια αντικείμενα ονομάζονται αντικείμενα φάσης. Αυτά περιλαμβάνουν ζωντανά, μη χρωματισμένα παρασκευάσματα. Για να αυξήσετε την αντίθεση της εικόνας, είναι απαραίτητο να μετατρέψετε τις αλλαγές φάσης σε πλάτους. Αυτό επιτυγχάνεται τοποθετώντας μια πλάκα φάσης σε σχήμα δακτυλίου στους αντικειμενικούς φακούς και χρησιμοποιώντας ένα δακτυλιοειδές διάφραγμα. Κάθε φακός έχει το δικό του διάφραγμα. Η εικόνα αυτού του διαφράγματος συμπίπτει με τον δακτύλιο της πλάκας φάσης του αντίστοιχου αντικειμενικού φακού. Η μέθοδος αντίθεσης φάσης μπορεί να είναι θετική ή αρνητική. Στην πρώτη περίπτωση, παρατηρείται μια σκοτεινή εικόνα του αντικειμένου σε φόντο ανοιχτού πεδίου, ενώ στη δεύτερη περίπτωση, το φόντο είναι σκοτεινό και το αντικείμενο είναι ανοιχτό. Τα καλύτερα αποτελέσματα παρατηρούνται σε περίπτωση θετικής αντίθεσης.
Η διάδοση των κυμάτων φωτός σε διαφανή ομοιογενή αντικείμενα δεν συνοδεύεται από απώλεια της έντασης του φωτός. Μόνο η ταχύτητα διέλευσης της φωτεινής ροής μέσα από το αντικείμενο αλλάζει σε σύγκριση με την ταχύτητα διάδοσης του φωτός στο περιβάλλον. Θα είναι μεγαλύτερος ή μικρότερος ανάλογα με το αν ο δείκτης διάθλασης του αντικειμένου είναι αντίστοιχα μικρότερος ή μεγαλύτερος από ό,τι στο περιβάλλον. Αυτές οι αλλαγές, που αλλιώς ονομάζονται αλλαγές φάσης, καθώς αλλάζουν μόνο τη φάση των ταλαντώσεων του μεταδιδόμενου φωτός, είναι χαρακτηριστικές των περισσότερων βιολογικών αντικειμένων (ζωντανά κύτταρα, τμήματα ιστών κ.λπ.).
Το ανθρώπινο μάτι καθορίζει καλά τις αλλαγές στην ένταση του φωτός που συμβαίνουν κατά τη διέλευση από έγχρωμα (πλάτους) παρασκευάσματα, όταν αλλάζει το πλάτος των ταλαντώσεων φωτός. Ωστόσο, το μάτι δεν είναι σε θέση να αντιληφθεί αλλαγές φάσης στο φως. Επομένως, τα διαφανή αντικείμενα χωρίς αντίθεση (φάσης) παραμένουν αόρατα κατά τη συμβατική μικροσκοπική εξέταση.
Για να εργαστείτε με τη μέθοδο της αντίθεσης φάσης, είναι απαραίτητο, εκτός από το συνηθισμένο βιολογικό μικροσκόπιο, να έχετε μια ειδική συσκευή. Η εγκατάσταση της συσκευής γίνεται ως εξής. Ο συμπυκνωτής και ο φακός αντικαθίστανται με φασικούς. Ο συμπυκνωτής φάσης ρυθμίζεται στο 0 περιστρέφοντας τον περιστρεφόμενο δίσκο. Αυτή η θέση αντιστοιχεί σε έναν συμβατικό συμπυκνωτή φωτεινού πεδίου. Στη συνέχεια, τοποθετώντας το παρασκεύασμα στο τραπέζι των αντικειμένων και εστιάζοντας το, αρχίζουν να προσαρμόζουν τον φωτισμό. Κατά τη μελέτη με τη μέθοδο της αντίθεσης φάσης, η κύρια προϋπόθεση είναι ο βέλτιστος φωτισμός, ο οποίος επιτυγχάνεται με τη ρύθμιση του φωτός σύμφωνα με την Koehler. Μετά από αυτό, ρυθμίστε τον περιστρεφόμενο δίσκο στον αριθμό που αντιστοιχεί στον επιλεγμένο φακό. για παράδειγμα, με έναν φακό ´40, ο αριθμός 40 ορίζεται επίσης στο παράθυρο. Μετά την αφαίρεση του προσοφθάλμιου φακού, ένα βοηθητικό μικροσκόπιο τοποθετείται στη θέση του και προσαρμόζεται ώστε να απεικονίζει δύο δακτυλίους (το δακτυλιοειδές διάφραγμα του συμπυκνωτή και η πλάκα φάσης) . Η συσκευή κεντραρίσματος του συμπυκνωτή επιτυγχάνει την ευθυγράμμιση των δακτυλίων. Αντικαθιστώντας το βοηθητικό μικροσκόπιο με προσοφθάλμιο, είναι δυνατό να μελετηθεί το παρασκεύασμα.
Η μέθοδος ανοπτρικής αντίθεσης είναι μια βελτίωση της μεθόδου αντίθεσης φάσης. Οι θεωρητικές αιτιολογήσεις και τα χαρακτηριστικά σχεδιασμού της ανοπτρικής συσκευής βασικά δεν διαφέρουν από τη συνηθισμένη ρύθμιση αντίθεσης φάσης (Εικ. 6). Η αρχή της συσκευής του είναι η εξής. Στην επάνω επιφάνεια του προτελευταίου φακού ενός αντικειμενικού αντικειμενικού φακού, εφαρμόζεται ένας δακτύλιος αιθάλης, ο οποίος μεταδίδει μόνο το 10% περίπου του εκπεμπόμενου φωτός. Στο μπροστινό εστιακό επίπεδο του συμπυκνωτή τοποθετείται ένα δακτυλιοειδές διάφραγμα, η εικόνα του οποίου πρέπει να συμπίπτει πλήρως με τον δακτύλιο αιθάλης στον αντικειμενικό φακό. Το παρασκεύασμα φωτίζεται από έναν πλήρη κώνο ακτίνων που διέρχεται από το δακτυλιοειδές διάφραγμα του συμπυκνωτή. Ελλείψει αντικειμένων (για παράδειγμα, μικρόβια στο παρασκεύασμα), μόνο μη διαθλασμένες ακτίνες εισέρχονται στον φακό, το πλάτος των οποίων, αφού περάσουν από τον δακτύλιο αιθάλης, θα μειωθεί κατά 90%. Ταυτόχρονα, το πλάτος των ακτίνων που διαθλώνται από τα σωματίδια του αντικειμένου που περνούν από τον δακτύλιο αιθάλης δεν θα αλλάξει και επομένως το φόντο του πεδίου θα είναι σκοτεινό, ενώ τα σωματίδια του αντικειμένου θα είναι ελαφρύ. Το πλεονέκτημα της ανοπτρικής μικροσκοπίας είναι η υψηλή ανάλυση των στόχων και η δυνατότητα ανίχνευσης ελάχιστων διαφορών οπτικής πυκνότητας σε μη χρωματισμένα παρασκευάσματα. Όσο μεγαλύτερη είναι η οπτική πυκνότητα ενός αντικειμένου, τόσο πιο φωτεινή είναι η εικόνα του. Η μέθοδος χρήσης της συσκευής δεν διαφέρει από την αντίθεση φάσης. Χρησιμοποιώντας ένα ανοπτρικό μικροσκόπιο, μπορεί κανείς να μελετήσει τη μορφολογία και τον εντοπισμό των νουκλεοειδών (πυρηνική συσκευή), να παρατηρήσει αλλαγές στη μορφολογία των βακτηρίων κατά την κανονική ανάπτυξη και αναπαραγωγή.
Διάγραμμα μικροσκοπίου αντίθεσης φάσης.
1. Δακτύλιος συμπυκνωτή
2. Επίπεδο θέματος
3. Πλάκα φάσης
4. Κύρια εικόνα.
Σε αντίθεση με το φως αναφοράς, το φως του αντικειμένου που είναι διάσπαρτο στο δείγμα, στις περιοχές που απεικονίζονται με μπλε, παρακάμπτει την πλάκα φάσης, επομένως το μήκος της οπτικής διαδρομής του είναι διαφορετικό
Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης- μέθοδος λήψης εικόνων σε οπτικά μικροσκόπια, στην οποία η μετατόπιση φάσης ενός ηλεκτρομαγνητικού κύματος μετατρέπεται σε αντίθεση έντασης. Το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης ανακαλύφθηκε από τον Fritz Zernike, για το οποίο έλαβε το βραβείο Νόμπελ το 1953.
Λειτουργική αρχή
Για να ληφθεί μια εικόνα αντίθεσης φάσης, το φως από την πηγή χωρίζεται σε δύο συνεκτικές δέσμες φωτός, η μία από αυτές ονομάζεται αναφορά, η άλλη είναι το αντικείμενο, που διέρχεται από διαφορετικές οπτικές διαδρομές. Το μικροσκόπιο ρυθμίζεται έτσι ώστε στο εστιακό επίπεδο όπου σχηματίζεται η εικόνα, η παρεμβολή μεταξύ των δύο ακτίνων να τις ακυρώνει.
Εικόνα κυττάρου σε μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης
Το μήκος της οπτικής διαδρομής αλλάζει χρησιμοποιώντας τη λεγόμενη πλάκα φάσης (Αγγλικά)Ρωσική που βρίσκεται στον δακτύλιο φάσης. Όταν ένα δείγμα βρίσκεται στη διαδρομή μιας από τις ακτίνες, η διάθλαση του φωτός σε αυτό αλλάζει την οπτική διαδρομή και, κατά συνέπεια, τη φάση, η οποία αλλάζει τις συνθήκες παρεμβολής.
Η μικροσκοπία αντίθεσης φάσης είναι ιδιαίτερα δημοφιλής στη βιολογία, επειδή δεν απαιτεί προ-χρώση του κυττάρου, η οποία μπορεί να προκαλέσει το θάνατό του.
Ιστορικό ανακάλυψης
Ο Ολλανδός φυσικός, μαθηματικός και χημικός Fritz Zernike ξεκίνησε να εργάζεται στον τομέα της οπτικής το 1930. Την ίδια χρονιά ανακάλυψε τη μέθοδο της αντίθεσης φάσης. Κατά τη διάρκεια των δεκαετιών 1930 και 1940, ο Zernike συνεισέφερε σε άλλες πτυχές της οπτικής, ενώ η μέθοδος αντίθεσης φάσης δεν έγινε αντιληπτή από έναν ευρύ κύκλο επιστημόνων. Η νέα μέθοδος παρέμεινε εκτός επιστημονικής κοινότητας μέχρι τον Β' Παγκόσμιο Πόλεμο, όταν, κατά τη διάρκεια της γερμανικής κατοχής της Ολλανδίας, η ανακάλυψη του Zernike χρησιμοποιήθηκε για την κατασκευή των πρώτων μικροσκοπίων αντίθεσης φάσης. Κατά τη διάρκεια του πολέμου, πολλοί κατασκευαστές άρχισαν να παράγουν μικροσκόπια αντίθεσης φάσης και άρχισαν να χρησιμοποιούνται ευρέως στη βιολογική και ιατρική έρευνα.
Συνδέσεις
Πηγές
Ίδρυμα Wikimedia. 2010 .
Δείτε τι είναι το "Μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης" σε άλλα λεξικά:
Δείτε Μικροσκόπιο κάτω από μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης. (Πηγή: Γλωσσάρι Μικροβιολογικών Όρων) ... Λεξικό μικροβιολογίας
Μέθοδος εξέταση με μικροσκόπιο, με βάση τη λήψη, με τη βοήθεια ειδικών συσκευών, μια εικόνα αντίθεσης δομών άχρωμων διαφανών μικροαντικειμένων που διαφέρουν σε πυκνότητα, για παράδειγμα, ζωντανών μικροοργανισμών και ιστών ...
ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΑΝΤΙΘΕΤΑΣ ΦΑΣΗΣ- μικροσκοπία αντίθεσης φάσης, βλέπε Μικροσκόπιο, Μικροσκοπική τεχνική ... Κτηνιατρικό Εγκυκλοπαιδικό Λεξικό
οπτικό μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης- Μέθοδος οπτικής μικροσκοπίας αντίθεσης φάσης 4,34 μικροσκοπικής ανάλυσης που βασίζεται στη μετατροπή των διαφορικών μετατοπίσεων φάσης των κυμάτων φωτός που διέρχονται από ένα δείγμα σε διαφορές στο πλάτος. ... ... Λεξικό-βιβλίο αναφοράς όρων κανονιστικής και τεχνικής τεκμηρίωσης
Μ. ζωντανά άβαφα αντικείμενα, στα οποία η αντίθεση της εικόνας αυξάνεται μετατρέποντας τις διαφορές φάσης της δέσμης των ακτίνων φωτός που διέρχονται από το αντικείμενο σε πλάτος ... Μεγάλο Ιατρικό Λεξικό
Η γενική ονομασία για τις μεθόδους παρατήρησης αντικειμένων που δεν διακρίνονται από το ανθρώπινο μάτι μέσω μικροσκοπίου. Βλέπε άρθ. (βλ. ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΟ). Φυσικό Εγκυκλοπαιδικό Λεξικό. Μόσχα: Σοβιετική Εγκυκλοπαίδεια. Αρχισυντάκτης A. M. Prokhorov. 1983... Φυσική Εγκυκλοπαίδεια
Ένα σύνολο μεθόδων για τη μελέτη μικρών αντικειμένων χρησιμοποιώντας μικροσκόπια. Οι παραδοσιακοί τύποι Μ. περιλαμβάνουν - φωταύγεια Μ. - με βάση το φαινόμενο της φωτοφωταύγειας που εμφανίζεται κατά τη χρώση παρασκευασμάτων με ειδικές φωταυγείς βαφές· ... ... Λεξικό μικροβιολογίας
Σχέδιο μικροσκοπίας σκοτεινού πεδίου σε προσπίπτον φως. Το δείγμα φωτίζεται από το πλάι (πράσινη γραμμή). Η εικόνα δημιουργείται από φως που διασκορπίζεται από ανωμαλίες στο δείγμα. Άποψη μικροσκοπίου σκοτεινού πεδίου οπτικού ... Wikipedia
Μια μέθοδος για τη μελέτη κυρίως ζώντων αντικειμένων χαμηλής αντίθεσης (πρωτόζωα, βακτήρια, κύτταρα σε καλλιέργεια) χρησιμοποιώντας ένα ανοπτρικό μικροσκόπιο (που εφευρέθηκε το 1953 από τον Φινλανδό φυσιολόγο A. Wilska), έναν τύπο μικροσκοπίου αντίθεσης φάσης ... Μεγάλη Σοβιετική Εγκυκλοπαίδεια
Τρόποι μελέτης διαφόρων αντικειμένων χρησιμοποιώντας μικροσκόπιο. Στη βιολογία και την ιατρική, αυτές οι μέθοδοι καθιστούν δυνατή τη μελέτη της δομής μικροσκοπικών αντικειμένων των οποίων οι διαστάσεις βρίσκονται πέρα από την ανάλυση του ανθρώπινου ματιού. Η βάση του Μ.μ.ι. συνθέτει…… Ιατρική Εγκυκλοπαίδεια
ΜΙΚΡΟΣΚΟΠΙΑ ΑΝΤΙΘΕΤΑΣ ΦΑΣΗΣ- μέθοδος μικροσκοπικής εξέτασης διαφανών, μη απορροφητικών αντικειμένων που βασίζεται στη βελτίωση της αντίθεσης εικόνας.
Διαφανή, μη λεκιασμένα αντικείμενα (ζωντανοί και σταθεροί μικροοργανισμοί, κύτταρα κ.λπ.) που διαφέρουν από περιβάλλονσύμφωνα με τον δείκτη διάθλασης, δεν απορροφούν το φως, αλλά αλλάζουν την ταχύτητά του και, κατά συνέπεια, τη φάση των δονήσεων του φωτός. Επιπλέον, ο βαθμός αυτών των αλλαγών εξαρτάται από την τιμή του δείκτη διάθλασης και το πάχος των δομών των αντικειμένων. Ωστόσο, αυτές οι αλλαγές δεν γίνονται αντιληπτές από το μάτι, δεν καταγράφονται από φωτογραφικό υλικό και τα αντικείμενα που μελετώνται σε μικροσκόπιο φωτός σχεδόν δεν διαφέρουν από το φόντο. Το μικροσκόπιο αντίθεσης φάσης χρησιμοποιείται για τη βελτίωση της αντίθεσης της εικόνας. Χρησιμοποιείται ευρέως για in vivo μελέτη μικροοργανισμών, πρωτόζωων, φυτικών και ζωικών κυττάρων. Στην αιματολογία, για παράδειγμα, η μικροσκοπία με αντίθεση φάσης χρησιμοποιείται για την καταμέτρηση και τη διαφοροποίηση των κυττάρων, τη μελέτη της κινητικότητάς τους, τη διαφορική διάγνωση της λευχαιμίας κ.λπ.
Μια μέθοδος μετατροπής των αλλαγών φάσης σε αλλαγές πλάτους που αντιστοιχούν σε αυτές προτάθηκε στη δεκαετία του '30 του 20ου αιώνα από τον Ολλανδό φυσικό F. Zernike. Η αρχή της μικροσκοπίας αντίθεσης φάσης είναι ότι το φως, που δεν εκτρέπεται από ένα αντικείμενο, διέρχεται μέσω ενός δακτυλίου φάσης που εφαρμόζεται σε έναν από τους αντικειμενικούς φακούς, μετατοπίζοντας τη φάση του κατά ένα τέταρτο του μήκους κύματος και μειώνοντας την έντασή του (προκειμένου να εξισωθεί με την ένταση του φωτός που διαθλάται από το αντικείμενο).
Η διέλευση του άμεσου φωτός που δεν διαθλάεται από το αντικείμενο μέσω του δακτυλίου φάσης εξασφαλίζεται από το δακτυλιοειδές διάφραγμα που βρίσκεται στον συμπυκνωτή, η προβολή του οποίου στο επίπεδο της κόρης εξόδου του φακού είναι ίση σε διάμετρο και πλάτος με τον δακτύλιο φάσης και πρέπει να συμπίπτει πλήρως με αυτό. Κάθε φακός έχει το δικό του δακτυλιοειδές διάφραγμα.
Στο επίπεδο εικόνας, εμφανίζεται η παρεμβολή των κυμάτων φωτός που έχουν περάσει και δεν έχουν περάσει από τον δακτύλιο φάσης. Σε αυτήν την περίπτωση, προκύπτουν διαφορές στο πλάτος, αντανακλώντας τις αλλαγές φάσης ανάλογα με τις ιδιότητες των τμημάτων του αντικειμένου. Σε αντίθεση με τις αλλαγές πλάτους φάσης στα κύματα φωτός, είναι καθαρά ορατές στο μάτι και μπορούν να καταγραφούν.
Ανάλογα με τη μέθοδο κατασκευής του δακτυλίου φάσης, η φάση του άμεσου φωτός που δεν διαθλάται από το αντικείμενο μπορεί είτε να οδηγήσει τη φάση του περιθλαμένου φωτός είτε να καθυστερήσει. Σε αυτήν την περίπτωση, εμφανίζεται είτε η πιο κοινή αντίθεση θετικής φάσης, όπου τα σωματίδια με δείκτη διάθλασης μεγαλύτερο από αυτόν του περιβάλλοντος (πιο πυκνό) φαίνονται σκοτεινά σε ανοιχτό φόντο, είτε αρνητικά, όπου τα ίδια σωματίδια δίνουν μια εικόνα ελαφρύτερη από το περιβάλλον Ιστορικό. Ωστόσο, πρέπει να σημειωθεί ότι αυτό το μοτίβο διατηρείται μόνο μέχρι μια ορισμένη τιμή του δείκτη διάθλασης και αφού φτάσει σε αυτήν την τιμή, η αντίθεση αντιστρέφεται, δηλαδή παρατηρούνται αντίστροφα μοτίβα.
Μια συσκευή αντίθεσης φάσης (ιδιαίτερα η KF-4 που κατασκευάζεται στη χώρα μας) αποτελείται από αντικειμενικούς φακούς με δακτύλιο φάσης που εφαρμόζεται σε έναν από τους φακούς, συμπυκνωτή με δίσκο πυργίσκου που περιέχει ένα σύνολο δακτυλιοειδών διαφραγμάτων και μια συσκευή κεντραρίσματος, και βοηθητικό μικροσκόπιο (Εικ. 1), με το οποίο, στο επίπεδο της κόρης εξόδου του φακού, μπορεί κανείς να παρατηρήσει την ευθυγράμμιση του δακτυλίου φάσης και την προβολή του δακτυλιοειδούς διαφράγματος του συμπυκνωτή. Αυτή η συσκευή μπορεί να εγκατασταθεί σε οποιοδήποτε μικροσκόπιο.
Υπάρχουν πολλές εποικοδομητικές ποικιλίες συσκευών αντίθεσης φάσης: με ένα δακτυλιοειδές διάφραγμα για όλους τους φακούς κατά τη χρήση παγκρατικού συμπυκνωτή (για παράδειγμα, σε οικιακά μικροσκόπια MBI-6, MBI-15), με τη λεγόμενη απομακρυσμένη κόρη, σε το οποίο ο δακτύλιος φάσης τοποθετείται έξω από το φακό, γεγονός που επιτρέπει τη χρήση συμβατικών φακών για μικροσκοπία αντίθεσης φάσης (μια τέτοια συσκευή διατίθεται στα οικιακά μικροσκόπια MBI-13, MBI-17). Υπάρχουν επίσης συσκευές με μεταβλητή αντίθεση φάσης (με δύο δακτυλίους διαφορετικής διαμέτρου).
Μία από τις ποικιλίες αντίθεσης αρνητικής φάσης είναι μια συσκευή οπτρικής (φάσης-σκοτεινού πεδίου). Η συσκευή anoptral δημιουργήθηκε το 1953 από τον A. Wilska και χρησιμοποιείται για τη μελέτη αντικειμένων που εισάγουν μια μικρή μετατόπιση φάσης. Μια τροποποίηση αυτής της μεθόδου προτάθηκε από τον M. A. Peshkov και χρησιμοποιήθηκε ευρέως στη χώρα μας.
Η τεχνική παρασκευής παρασκευασμάτων για μικροσκοπία αντίθεσης φάσης εξαρτάται από το αντικείμενο μελέτης και τη διάρκεια της μελέτης: μη χρωματισμένοι μικροοργανισμοί μπορούν να ληφθούν υπόψη σε παρασκευάσματα θρυμματισμένης σταγόνας (βλ.), για μακροχρόνια παρατήρηση και εγγραφή φιλμ της αναπαραγωγής μικροοργανισμών, ειδικές μικροκάμερες άγαρ (βλ.) χρησιμοποιούνται σε γυάλινες πλάκες (θάλαμος Fontbrun, θάλαμος Peshkov σε σχήμα HI). Οι μικροθάλαμοι (στάσιμοι και αιμάτωσης) χρησιμοποιούνται επίσης για τη μελέτη της δυναμικής των διεργασιών σε καλλιέργειες ιστού μίας στιβάδας. Πολύ σημαντικοί παράγοντες που καθορίζουν σε μεγάλο βαθμό την ποιότητα της εικόνας είναι το πάχος του σκευάσματος και οι διαφορές στους δείκτες διάθλασης του αντικειμένου και του μέσου.
Η τεχνική της μικροσκοπίας αντίθεσης φάσης είναι σχετικά απλή: οι φακοί και ο συμπυκνωτής του μικροσκοπίου αντικαθίστανται με ειδικούς (σε εγχώριους φακούς αντίθεσης φάσης υπάρχει η ονομασία F, σε ξένους - Ph), ο δίσκος συμπυκνωτή έχει ρυθμιστεί στη θέση O (δηλαδή μια διαμπερής οπή χωρίς δακτυλιοειδές διάφραγμα), το παρασκεύασμα τοποθετείται στο τραπέζι, το φως ρυθμίζεται σύμφωνα με τον Koehler (βλ. Μικροσκοπικές μέθοδοι έρευνας), ένα δακτυλιοειδές διάφραγμα εισάγεται περιστρέφοντας το δίσκο, που αντιστοιχεί στο μεγέθυνση του φακού. Αντί για προσοφθάλμιο, τοποθετείται βοηθητικό μικροσκόπιο. Τραβώντας προς τα έξω το πάνω μέρος του, λαμβάνεται μια ευκρινής εικόνα του δακτυλίου φάσης και του δακτυλιοειδούς διαφράγματος. Οι βίδες κεντραρίσματος του συμπυκνωτή ευθυγραμμίζουν με ακρίβεια και τους δύο δακτυλίους, μετά από τους οποίους τοποθετείται προσοφθάλμιος αντί για βοηθητικό μικροσκόπιο. Κατά την αλλαγή του φαρμάκου, συνιστάται να ελέγχετε την ευθυγράμμιση των δακτυλίων (Εικ. 2).
Το πλεονέκτημα της μικροσκοπίας αντίθεσης φάσης είναι η ικανότητα διεξαγωγής ενδοβιολογικών παρατηρήσεων (χωρίς καμία επεξεργασία) βιολ. αντικείμενα, για παράδειγμα, μακροφάγα (Εικ. 3), και το μειονέκτημα είναι η εμφάνιση ενός φωτεινού (σε περίπτωση θετικής αντίθεσης) ή σκούρου (σε περίπτωση αρνητικού) φωτοστέφανου γύρω από το αντικείμενο και τις δομές του. Πιο πλήρεις πληροφορίες μπορούν να ληφθούν συνδυάζοντας μικροσκοπία αντίθεσης φάσης και φωταύγειας χρησιμοποιώντας μεθόδους ανοσοφωταύγειας (βλέπε Ανοσοφθορισμός) και φωτοκυτταροχημικών μεθόδων (βλέπε μικροσκόπιο φωταύγειας). Όταν εργάζεστε με ορούς φωταύγειας, η μικροσκοπία αντίθεσης φάσης καθιστά δυνατή την επαλήθευση της παρουσίας ενός μικροαντικειμένου εάν δεν δεσμεύει τα αντισώματα φωταύγειας, καθώς και τη μελέτη αντικειμένων στα οποία τα αντισώματα είναι στερεωμένα σε ξεχωριστές δομές.
Ιδιαίτερα μεγάλο ρόλο στην ενδοβιολογική κυτταρολογική μελέτη της δυναμικής διαφόρων φυσιολογικών και παθολογικών διεργασιών στην κυτταρική βιολογία, τη μικροβιολογία, την ιολογία έπαιξε ο συνδυασμός της αντίθεσης φάσης και της ανοπτρικής μικροσκοπίας με μικροφίλμ (βλ.). Αυτή η μέθοδος έχει χρησιμοποιηθεί για τη μελέτη της κυτταρολογίας βακτηρίων και πρωτόζωων, μίτωση σε διάφορα κύτταρα, κυτταροπαθητική δράση ιών και ρικετσιών στα κύτταρα. Μελετήθηκαν επίσης τα χαρακτηριστικά του σχηματισμού και της ανάπτυξης των μορφών L βακτηρίων και μυκοπλασμάτων, η επίδραση των αντιβιοτικών στα βακτήρια.
Βιβλιογραφία: Kravchenko A. T., Milyutin V. N. and Gudima O. S. Microfilming in biology, Μ., 1963; Κατευθυντήριες οδηγίες για τη μικροβιολογική διάγνωση λοιμωδών νοσημάτων, εκδ. K. I. Matveeva, σελ. 5, 25, Μ., 1973; Skvortsov G. E. et al., Microscopes, L., 1969; Franson M. Μικροσκόπια αντίθεσης φάσης και παρεμβολής, μτφρ. από γαλλικά, Μόσχα, 1960; Κινηματογραφία στην κυτταρική βιολογία, εκδ. από G. G. Rose, Ν. Υ.-L., 1963; Zernike F. Diff-raktion theory of the knife edge test and the βελτιωμένη μορφή της της μεθόδου αντίθεσης φάσης, Physica, v. 1, σελ. 689, 1934.
M. Ya. Korn, E. S. Stanislavsky.
Μέθοδος αντίθεσης φάσηςκαι η ποικιλία του - το λεγόμενο. "ανοπτρική" μέθοδος αντίθεσηςέχει σχεδιαστεί για να λαμβάνει εικόνες διαφανών και άχρωμων αντικειμένων που είναι αόρατα όταν παρατηρούνται χρησιμοποιώντας τη μέθοδο φωτεινού πεδίου. Αυτά περιλαμβάνουν, για παράδειγμα, ζωντανούς μη λεκιασμένους ζωικούς ιστούς. Η ουσία της μεθόδου είναι ότι ακόμη και με πολύ μικρές διαφορές στους δείκτες διάθλασης διαφορετικά στοιχείατου φαρμάκου, το κύμα φωτός που διέρχεται από αυτά υφίσταται διαφορετικές αλλαγές φάσης (αποκτά τη λεγόμενη ανακούφιση φάσης). Δεν γίνονται αντιληπτές άμεσα ούτε από το μάτι ούτε από τη φωτογραφική πλάκα, αυτές οι αλλαγές φάσης μετατρέπονται από μια ειδική οπτική συσκευή σε αλλαγές στο πλάτος του φωτεινού κύματος, δηλαδή σε αλλαγές στη φωτεινότητα («ανακούφιση πλάτους»), οι οποίες διακρίνονται ήδη από το μάτι ή στερεωμένο στο φωτοευαίσθητο στρώμα. Με άλλα λόγια, στην προκύπτουσα ορατή εικόνα, η κατανομή της φωτεινότητας (πλάτη) αναπαράγει την ανακούφιση φάσης. Η εικόνα που προκύπτει ονομάζεται αντίθεση φάσης.
Ένα τυπικό σχήμα της λειτουργίας της μεθόδου: ένα διάφραγμα ανοίγματος είναι εγκατεστημένο στην μπροστινή εστία του συμπυκνωτή, η οπή του οποίου έχει σχήμα δακτυλίου. Η εικόνα του εμφανίζεται κοντά στην πίσω εστία του φακού, και το λεγόμενο. μια πλάκα φάσης, στην επιφάνεια της οποίας υπάρχει μια δακτυλιοειδής προεξοχή ή μια δακτυλιοειδής αυλάκωση, που ονομάζεται δακτύλιος φάσης. Η πλάκα φάσης δεν τοποθετείται πάντα στο επίκεντρο του αντικειμενικού φακού - συχνά ο δακτύλιος φάσης εφαρμόζεται απευθείας στην επιφάνεια ενός από τους αντικειμενικούς φακούς. Σε κάθε περίπτωση, οι ακτίνες του φωτιστικού που δεν εκτρέπονται στο παρασκεύασμα, δίνοντας την εικόνα του διαφράγματος, πρέπει να περάσουν εντελώς από τον δακτύλιο φάσης, ο οποίος τις εξασθενεί σημαντικά (γίνεται απορροφητικός) και αλλάζει τη φάση τους κατά /4. ( είναι το μήκος κύματος του φωτός). Και οι ακτίνες, ακόμη και ελαφρώς εκτρεπόμενες (διεσπαρμένες) στο παρασκεύασμα, περνούν από την πλάκα φάσης, παρακάμπτοντας τον δακτύλιο φάσης και δεν υφίστανται πρόσθετη μετατόπιση φάσης. Λαμβάνοντας υπόψη τη μετατόπιση φάσης στο υλικό του δείγματος, η συνολική διαφορά φάσης μεταξύ των ακτίνων που εκτρέπονται και δεν εκτρέπονται είναι κοντά στο 0 ή /2, και ως αποτέλεσμα της παρεμβολής φωτός στο επίπεδο εικόνας του δείγματος, ενισχύουν ή εξασθενούν αισθητά η μία την άλλη , δίνοντας μια εικόνα αντίθεσης της δομής του δείγματος. Οι εκτρεπόμενες δέσμες έχουν πολύ μικρότερο πλάτος σε σύγκριση με τις μη εκτρεπόμενες δέσμες, επομένως, η εξασθένηση της κύριας δέσμης στον δακτύλιο φάσης, φέρνοντας τις τιμές πλάτους πιο κοντά, οδηγεί επίσης σε μεγαλύτερη αντίθεση εικόνας. Η μέθοδος καθιστά δυνατή τη διάκριση μικρών στοιχείων της δομής, τα οποία παρουσιάζουν εξαιρετικά αδύναμη αντίθεση στη μέθοδο του φωτεινού πεδίου. Διαφανή σωματίδια, σχετικά μικρού μεγέθους, διασκορπίζουν τις ακτίνες φωτός σε τόσο μικρές γωνίες που αυτές οι ακτίνες περνούν μέσω του δακτυλίου φάσης μαζί με τις μη εκτρεπόμενες. Για τέτοια σωματίδια, το φαινόμενο της αντίθεσης φάσης λαμβάνει χώρα μόνο κοντά στα περιγράμματα τους, όπου εμφανίζεται ισχυρή σκέδαση.