Красиви рисунки върху клетките.

При микроскопията с пропусната светлина качеството на пробата не винаги улеснява наблюдението и записването на изображения с отличен контраст в простия режим на изобразяване в светло поле. Проучванията, фокусирани върху присъщи проби с нисък контраст, като неоцветени бактерии, тънки тъканни срезове и прилепнали живи клетки, разчитат на специализирани техники за подобряване на контраста, за да помогнат за визуализирането на тези практически прозрачни проби. При изследване на неоцветени проби, слабото поглъщане на светлина от пробата води до изключително малки промени в разликата в разпределението на интензитета между пробата и фона.

Когато фонът е ярък, човешкото око изисква локални флуктуации на интензитета от поне 10-20%, за да може да разпознае детайлите на пробата. За съжаление, това ниво на модулация рядко се наблюдава при прозрачни проби, които обикновено са почти невидими на фона на този интензитет. Терминът пропусната светлина, когато се използва в оптичната микроскопия, се отнася до всяка техника за изобразяване, при която светлината се предава от източник на светлина от противоположната страна на образеца към обект.

Техниките за подобряване на контраста, описани в този раздел, са различни методи за подготовка на проби, както и оптични трикове, които генерират промени в интензитета, които са полезни за наблюдение и изобразяване. Техниките, които подобряват контраста, включват диференциален интерференчен контраст, поляризирана светлина, фазов контраст, модулационен контраст на Хофман и тъмна микроскопия. Някои от тези техники са ограничени до светлина, произхождаща от области, далеч от фокалната равнина, когато се изобразяват по-дебели растителни и животински тъкани, докато поляризираната светлина изисква двойно пречупване, за да създаде контраст.

Илюстрацията на фиг. 1 са различни популярни методи за подобряване на контраста, които обикновено се използват в техниките на дифузна светлина. В тънкия участък от тъкан на фиг. 1 показва човешки базално-клетъчен карцином, оцветен с еозин и хематоксилин за цветен контраст в режим на изображение с високо поле. Фиксирана култура от клетки на индийска Muntiaca, монтирани във водна среда, е представена в контрастното контрастно изображение на Фигура 1. Една от основните и любими техники, използвани във всички форми на оптична микроскопия през последните три века, яркото осветление разчита на промени в светлината абсорбция, индекс на пречупване или цвят за създаване на контраст.

Разделителната способност в светла система зависи както от числените апертури на обектива, така и от кондензатора и е необходима среда за потапяне от двете страни на пробата. Цифровите фотоапарати осигуряват широк динамичен диапазон и пространствена разделителна способност, необходими за улавяне на информацията, присъстваща в ярко изображение. В допълнение, алгоритмите за изваждане на фона, използващи средни кадри, взети без проба в оптичния път, драстично увеличават контраста.

Обикновено ярко изображение с правилната настройка на микроскопа за осветяване на Koehler предоставя ограничена информация за контура на клетката, позицията на ядрото и местоположението на големи мехурчета в неоцветени проби. Контрастът в ярко изображение зависи от разликите в абсорбцията на светлината, индекса на пречупване или цвета. Оптичните разлики се развиват, когато светлината преминава през пробата, променяйки посоката, скоростта или спектралните характеристики на фронта на вълната на изображението. Въпреки това, общата липса на контраст в режим на светло поле при изследване на неоцветени проби прави този метод относително безполезен за сериозни изследвания на структурата на живите клетки.

Този метод е идеален за тънки, неоцветени образци, които са приблизително 5-10 µm над сърцевината, но с дебелина по-малка от микрометър в периферията. Такива проби почти не показват абсорбция на светлина във видимата част на спектъра и човешкото око не може да ги открие при ярка и тъмна светлина. Микроскопът трябва да бъде оборудван със специален кондензатор, съдържащ пръстеновидно пространство или серия от пръстени, съвпадащи с набор от мишени, съдържащи фазови пръстени в задната фокална равнина. Фазовият контраст е чудесен начин за увеличаване на контраста при гледане или изобразяване на живи клетки в култура, но обикновено води до ореоли около очертанията на ръбовите характеристики.

Тези ореоли са оптични артефакти, които често намаляват видимостта на детайлите по ръбовете. Методът не е полезен за дебели проби, тъй като фазовите измествания се появяват в зони далеч от фокалната равнина, което изкривява детайлите на изображението. В допълнение, плаващи отломки и други фазови обекти извън фокус пречат на формирането на лепкави клетъчни изображения върху покривните стъкла.

Фазовият контраст прави тези малки разлики видими чрез оптична манипулация, като ги превежда например в разлики в интензитета, които могат да бъдат визуално наблюдавани и записани. Оптичният ефект, използван в този случай, се състои от изместване на фазовите отношения между светлинните вълнови фронтове, преминаващи през различни части на пробата. По време на пътуването си през ядрата на клетките, цитоплазмата или водата, светлинните вълни се изместват с малки степени, тъй като тези среди имат малко по-различни индекси на пречупване.

Размерът на забавянето се нарича фазово изместване. Преди да влязат в пробата, вълните все още са във фаза, но това вече не е така, когато са преминали през различни материали с различни индекси на пречупване. Големината на фазовото изместване зависи от коя среда вълните са преминали по пътя си и колко дълго са преминали пътищата през тези среди. Човешкото око не може да види тези фазови измествания в микроскопското изображение, то е в състояние да различи различни интензитети и цветове. Следователно методът на фазовия контраст използва оптични трикове, за да преведе фазовите отмествания в стойности на сивото.

В конфигурацията на микроскоп с фазов контраст диафрагмата на апертурата на кондензатора се заменя с фазов ограничител, който осветява пробата през оптичните компоненти на кондензатора в кух конус от светлина, както е показано на фигура 3. Тези вълнови фронтове навлизат в обектива и изображението на фазовия стоп се създава в задната фокална равнина. Разположена в лещата, задната фокална равнина е фазов пръстен или плоча, която не само отслабва ярката директна светлина, която е резултат от спиране на фазата в кондензатора, но също така добавя постоянно фазово изместване към тази светлина.

Вълновите фронтове, дифрактирани от пробата, няма да преминат през фазовия пръстен в обектива, което означава, че няма да бъдат отслабени или забавени. Всички вълнови фронтове в крайна сметка се рекомбинират, за да образуват междинно изображение с помощта на тръбна леща.

Вълнови фронтове, всички от които са били наблюдавани в различни степенидетайлите в пробата се наслагват като междинно изображение върху изместените и отслабени вълнови фронтове, където те се подсилват или отслабват взаимно, образувайки окончателното фазово контрастно изображение, наблюдавано в окулярите. Тези процеси на интерференция в междинното изображение създават светли и тъмни области с различни структури с промени в индекса на пречупване в пробата. Оптимален контраст се създава чрез избор на правилните стойности на забавяне и затихване, което е функция на оптичните свойства на фазовия пръстен в апертурата на обектива.

Основният артефакт на изображението с фазов контраст е яркият светлинен ореол, който се появява в краищата около пробата. Халогенидите се намират в фазово контрастна микроскопия, тъй като фазовият пръстен с кръгло влакно, разположен в обективната фаза, също пропуска малко количество дифрактирана светлина от пробата. Проблемът се изостря от факта, че широчината на фронта на вълната на обема на недифрактирана светлина, проектирана върху фазовата плоча от празнината на кондензатора, е по-малка от действителната ширина на пръстена на фазовата плоча.

Дебелите проби, често показващи силно припокриващи се структури, произвеждат тежки артефакти с ореол. Следователно фазовият контраст е техника, която се препоръчва само за много тънки образци, където множество структури не лежат физически една върху друга. В дебела шарка детайлите могат да бъдат смесени в изображението, което в крайна сметка вече не е четливо.

Фазовият контраст изисква специални мишени, които са оборудвани с фазов пръстен близо до зеницата или задната бленда. Кондензаторът изисква едно, две или три фазови спирания в зависимост от мишените за фазов контраст, които са прикрепени към върха на микроскопа. Ако използвате фазов контраст само с един размер на пръстена, е достатъчно лесно да инсталирате и премахнете щепсела на подвижния кондензатор. Кула с множество монтажи е по-удобна, тъй като съдържа и трите фазови ограничители и позволява много бързо превключване по време на изобразяване.

Налични са допълнителни отвори за ирис, необходим при ярка светлина, и за тъмен ирис.


Центрирането се извършва с два малки гаечни ключа на купола на кондензатора. Ако искате да сте особено прецизни, използвайте центриращ телескоп, за да наблюдавате задната бленда на обектива, за да направите тези корекции, както е показано на фигурата. Този малък аксесоар изглежда като окуляр и се поставя в зрителна тръба вместо окуляр. Когато телескопът се фокусира върху зеницата на обектива, позицията на фазовите ограничители може да се наблюдава ясно.

Отново погледнете в зеницата на обектива и съгласувайте яркото изображение на фазата на кондензатора с фазовия пръстен на обектива. Това е ясно показано на фигури 4 и 4, фазовият ограничител не е подравнен с фазата на лещата, докато ограничителят и фазовата плоча са в перфектно съответствие на фигура 4.

Изображението на фазовия контраст на пробата може да бъде повлияно от правилния избор на забавяне на предния лъч чрез внимателен избор на фазовия пръстен в обектива. В зависимост от избраната стойност на забавяне, обектите с по-висок индекс на пречупване от заобикалящата ги среда изглеждат по-ярки или по-тъмни от заобикалящата ги среда. околен свят. Това също се нарича положителен или отрицателен фазов контраст. В съвременните микроскопи положителният фазов контраст е стандартен, когато тъмнината на обектите се увеличава с техния индекс на пречупване.