Фазово контрастный метод. Методы микроскопии (люминесцентная, темнопольная, фазово-контрастная, электронная). Взаимодействие световых волн с фазовыми образцами

Человеческий глаз различает только длину (цвет) и амплитуду (интенсивность, контрастность) световой вол­ны, но не улавливает различий в фазе. Почти все живые клетки прозрачны, так как свето­вые лучи, проходя через них, не меняют своей ампли­туды, хотя и изменяются по фазе. Превратить «фазо­вый» (неконтрастный) препарат в «амплитудный» (конт­растный) можно, либо окрашивая объект (для живых клеток этот прием малопригоден), либо снижая апер­туру конденсора путем прикрывания диафрагмы (при­ем также нежелателен, так как снижает разрешающую способность микроскопа).

Метод фазово-контрастной микроскопии разработан для наблюдения за прозрачными объектами, он осно­ван на преобразовании фазовых изменений, претерпе­ваемых световой волной при прохождении через объ­ект, в видимые аплитудные с помощью определенного оптического устройства. Если в объектив обычного микроскопа вмонтировать специальный диск - фазовую пла­стинку с кольцом (получается путем напыления диска солями редких металлов толщиной в несколько десятых микрометра), а в конденсор - кольцевую диафрагму (непроницаемую для лучей света пластинку с прозрач­ной щелью в виде кольца), так чтобы через конденсор и объектив проходило лишь кольцо света, которое за­тем совмещается с кольцом фазовой пластинки объек­тива, то фазы проходящего светового луча сдвигаются (обычно на 1/4длины волны), фазовые изменения пере­ходят в амплитудные, и препарат становится контраст­ным.

Для проведения исследований необходимо в допол­нение к световому микроскопу иметь фазовоконтрастное устройство (наиболее широко распространена мо­дель КФ-4), которое состоит из фазовых объективов (на оправе имеется буква «Ф»), конденсоров с набором кольцевых диафрагм и вспомогательного микроскопа (оптического устройства, помещаемого в тубус вместо окуляра при установке фазового контраста).

Метод применяют для исследования живых клеток микроорганизмов, контрастность которых достигается оптическим путем без вмешательства в физиологиче­ские процессы изучаемых объектов.

Контрольные вопросы:

1. В каких случаях применяется фазово-контрастная микроскопия?

2. На чём основан метод фазово-контрастной микроскопии?

3. Чем отличается конструкция фазово-контрастного микроскопа от обычного светового?

4. Как устроена фазово-контрастная модель КФ-4?

Люминесцентная, или флуоресцентная, микроскопия

Некоторые биологические объекты способны при ос­вещении коротковолновыми лучами (сине-фиолетовыми, ультрафиолетовыми) поглощать их и испускать лучи с более длинной волной. При этом клетки будут как бы светиться желто-зеленым или оранжевым светом. Это так называемая собственная, или первичная, люмине­сценция.

Нелюминесцирующие объекты можно обработать специальными флуорохромами (акридином желтым, ак­ридином оранжевым, аурамином, примулином, тиофлавином, конго красным, тетрациклином, хинином) и так­же наблюдать люминесценцию.

Это уже будет наведенная, или вторичная, люмине­сценция.

Препараты, окрашенные флуорохромами, изучают в средах, не люминесцирующих под действием коротковолновых лучей: в воде, глицерине, вазелиновом масле или физиологическом растворе.

Оптическая схема люминесцентного микроскопа отличается от обычной источником света (можно использовать ртутную лампу, а если возможно возбуждение люминесценции объекта сине-фиолетовыми лучами, то и низковольтные лампы) и наличием на пути лучей двух светофильтров: синий светофильтр перед конденсором, пропускающий сине-фиолетовые лучи видимого спектра, и жёлтый светофильтр - в окуляре микроскопа, убирающий синие лучи, мешающие выявлению люминесценции.

Люминесцентная микроскопия по сравнению с обычной позволяет сочетать цветное изображение и контрастность объектов; изучать морфологию живых и мёртвых клеток микроорганизмов в питательных средах и тканях животных и растений; исследовать клеточные микроструктуры, избирательно поглощающие различные флуорохромы, которые являются при этом как бы специфическими цитохимическими индикаторами; определить функционально-морфологические изменения клеток; использовать флуорохромы при иммунологических реакциях и подсчёте бактерий в образцах с невысоким их содержанием.

Электронная микроскопия

По схеме строения электронный микроскоп аналогичен световому, но освещение объекта обеспечивает не луч света, а поток электронов от вольфрамовой нити, нагреваемой электрическим током.

Разрешающая способность современных электронных микроскопов – 0,2-0,4 нм, рабочее увеличение в среднем – 100 000 раз.

Трансмиссионный электронный микроскоп.

Трансмиссионный (просвечивающий, пропускающий электроны сквозь объект) микроскоп широко применяют в биологических исследованиях.

Каждый электронный микроскоп состоит из электронной пушки (источник электронов); электромагнитных катушек, выполняющих роль конденсорной, объективной и проекционной линз предметного столика; экрана для изображения и окуляра. Для работы микроскопа необходим вакуумный насос, т.к. движение электронов возможно только в вакууме. Электроны в трансмиссионном микроскопе движутся по такому же пути, как и лучи света в световом микроскопе.

Изображение объекта можно сфотографировать, если заменить флуоресцирующий экран (металлическую пластину, покрытую тонким слоем сульфида цинкаили сульфида цинка с селенидом кадмия) фотопластинкой.

Препараты для электронно-микроскопических исследований помещают на специальные сетки, на которые нанесена тончайшая плёнка (подложка). Общая толщина препарата и подложки не должна превышать 0,25 мкм.

При исследовании морфологических особенностей клеток микроорганизмов под электронным микроскопом изучают целые клетки и их срезы, толщина которых не должна превышать 0,8-0,9 мкм.

Контрастность объекта обеспечивается напылением объекта тяжёлыми металлами (хромом, золотом, палладием) или обработкой контрастирующими веществами типа фосфорно-вольфрамовой кислоты и уранилацетата.

Сканирующий или растровый электронный микроскоп. Даёт объёмное почти трёхмерное изображение исследуемого объекта. В сканирующих микроскопах подвижный тонкий электронный луч очень быстро и последовательно обегает поверхность исследуемого образца по квадратному растру и передаёт полученную информацию на электронно-лучевую трубку, покрытую люминофором, светящимся под действием электронов.

Глубина фокуса сканирующего микроскопа достигает нескольких миллиметров; пределы полезного увеличения 10-50 тыс. раз, разрешающая способность меньше, чем у трансмиссионных.

Препараты для сканирующего микроскопа подвергают специальной обработке, основная цель которой - обезвоживание объекта без нарушения, (сморщивания) поверхности структур. Затем препарат покрывают тонким слоем сплава золота или платины, что делает поверхность образца электропроводной и позволяет избежать накопления электрического заряда, который может снизить разрешающую способность микроскопа.

При работе с электронным микроскопом следует строго соблюдать правила техники безопасности.

Задание:

Зарисовать схему устройства электронного микроскопа, пользуясь рис. 2 из цветного буклета.

Контрольные вопросы:

1. В чём преимущества люминесцентной микроскопии, на чём она основана?

2. Что означает первичная люминесценция?

3. Как можно получить наведенную или вторичную люминесценцию?

4. Какова разрешающая способность и рабочее увеличение современных электронных микроскопов?

5. На каком физическом явлении основана электронная микроскопия?

6. Назовите два типа электронных микроскопов.

7. Из каких узлов состоит электронный микроскоп?

8. В чём особенности пробоподготовки в трансмиссионном микроскопе?

9. В чём преимущества сканирующего или растрового микроскопирования?

10. Как готовят препараты для сканирующего микроскопа?

Фазово-контрастный микроскоп значительно повышает контра­стность объектов, проницаемых для света, и в медицине ис­пользуется для изучения нативных препаратов. С помощью этого метода могут быть исследованы без предварительной обработки бесцветные, прозрачные объекты, детали, строение которых оп­тически мало различаются между собой.

Окрашенные препараты частично поглощают свет. Пучок света, проходящий через такой препарат, теряет в своей ин­тенсивности, т.е. уменьшается амплитуда световой волны, и это легко улавливается глазом исследователя. Такие препараты контрастны даже в обычном микроскопе и называются “амплитуд­ными”. Препараты, не поглощающие света, прозрачны. Пучок света, проходящий через такой препарат, не теряет своей ин­тенсивности. Амплитуда световой волны не изменяется, а лишь изменяется фаза колебания, что не регистрируется человече­ским глазом. Такие объекты называются фазовыми. К ним отно­сятся живые, неокрашенные препараты. Чтобы повысить контра­стность изображения, необходимо превратить фазовые изменения в амплитудные. Это достигается путем помещения в объективы фазовой пластинки в форме кольца и применением кольцевой диафрагмы. Каждому объективу соответствует своя диафрагма. Изображение этой диафрагмы совпадает с кольцом фазовой пла­стинки соответствующего объектива. Метод фазовых контрастов может быть положительным и отрицательным. В первом случае на светлом фоне поля наблюдается темное изображение объекта, а во втором фон темный, а объект светлый. Наилучшие результаты наблюдаются в случае положительного контраста.

Распространение световых волн в прозрачных однородных объектах не сопровождается потерей интенсивности света. Ме­няется только скорость прохождения светового потока через объект по сравнению со скоростью распространения света в окружающей среде. Она будет большей или меньшей в зависимости от того, будет ли показатель светопреломления объекта соответственно меньше или больше, чем в окружающей среде. Эти изменения, называе­мые иначе фазовыми, так как при них меняются только фаза ко­лебаний прошедшего света, характерны для большинства биоло­гических объектов (живых клеток, срезов тканей и т. п.).

Человеческий глаз хорошо определяет изменения интенсив­ности света, наступающие при прохождении через окрашенные (амплитудные) препараты, когда меняется амплитуда колебаний света. Однако глаз не способен воспринимать фазовые измене­ния света. Поэтому прозрачные неконтрастные (фазовые) объ­екты при обычном микроскопическом исследовании остаются не­видимыми.

Для работы по методу фазового контраста нужно, кроме обычного биологического микроскопа, иметь еще специальное устройство. Установку устройства производят следующим обра­зом. Конденсор и объектив заменяют фазовыми. Фазовый конден­сор поворотом револьверного диска устанавливают на 0. Это положение соответствует обычному светопольному конденсору. Затем, поместив на предметный столик препарат и сфокусировав его, приступают к наладке освещения. При исследовании мето­дом фазового контраста основным условием является оптималь­ная освещенность, которая достигается установкой света по Келеру. После этого устанавливают револьверный диск на то число, которое соответствует выбранному объективу; например, при объективе ´40 в окошечке также устанавливают цифру 40. Вынув окуляр, на его место устанавливают вспомогательный микроскоп и настраивают его на изображение двух колец (коль­цевая диафрагма конденсора и фазовая пластинка). Центро­вочным устройством конденсора добиваются совмещения колец. Заменив вспомогательный микроскоп окуляром, можно произво­дить исследование препарата.

Метод аноптрального контраста является усовершенствованием метода фазового контраста. Теоретические обоснования и конструктивные особенности аноптрального устройства, в основном не отличаются от обычной фазово-контрастной установки (рис. 6). Принцип его устройства заключается в следующем. На верхнюю поверхность предпоследней линзы иммерсионного объектива наносится кольцо из сажи, пропускающей лишь около 10% проходящего света. В передней фокальной плоскости кон­денсора помещается кольцевая диафрагма, изображение которой должно полностью совпадать с кольцом сажи на объективе. Пре­парат освещается полным конусом лучей, проходящих через кольцевую диафрагму конденсора. При отсутствии объектов (например, микробов в препарате) в объектив попадают только недифрагированные лучи, амплитуда которых, после того как они пройдут через кольцо сажи, уменьшится на 90%. В то же время амплитуда лучей, дифрагированных частицами объекта, которые пройдут мимо кольца из сажи, не изменится и поэтому фон поля будет темный, а частицы объекта светлыми. Пре­имуществом метода аноптральной микроскопии является боль­шая разрешающая способность объективов и возможность выяв­ления минимальных оптических разностей плотности в неокра­шенных препаратах. Чем больше оптическая плотность объекта, тем светлее его изображение. Методика использования устрой­ства не отличается от фазово-контрастного. При помощи аноптрального микроскопа можно изучать морфо­логию и локализацию нуклеоидов (ядерный аппарат), наблюдать за изменениями морфологии бактерий в процессе нормального роста и размножения.

Схема фазово-контрастного микроскопа.
1. Кольцо конденсера
2. Предметная плоскость
3. Фазовая пластинка
4. Первичное изображение.
В отличие от опорного света, рассеянный на образце предметный свет, в областях, изображённых синим, минует фазовую пластинку, таким образом длина его оптического пути другая

Фазово-контрастная микроскопия - метод получения изображений в оптических микроскопах , при котором сдвиг фаз электромагнитной волны трансформируется в контраст интенсивности. Фазовоконтрастную микроскопию открыл Фриц Цернике , за что получил Нобелевскую премию за 1953 год .

Принцип действия

Для получения фазовоконтрастного изображения свет от источника разбивается на два когерентных световых луча, один из них называют опорным, другой предметным, которые проходят разные оптические пути . Микроскоп юстируют таким образом, чтобы в фокальной плоскости, где формируется изображение, интерференция между этими двумя лучами гасила бы их.

Изображение клетки в фазово-контрастном микроскопе

Длину оптического пути изменяют с помощью так называемой фазовой пластинки (англ.) русск. , расположенной на фазовом кольце. Когда на пути одного из лучей находится образец, преломление света в нём изменяет оптический путь, а, следовательно, и фазу, что изменяет условия интерференции.

Фазово-контрастная микроскопия особенно популярна в биологии, поскольку не требует предварительного окрашивания клетки , из-за которого та может погибнуть.

История открытия

Голландский физик, математик и химик Фриц Цернике в 1930 году начал работать в области оптики. В этом же году он открыл фазово-контрастный метод. В течение 1930-1940-х годов Цернике внёс свой вклад и в других вопросах оптики, в то время как фазово-контрастный метод не был замечен широкими кругами учёных. Новый метод оставался вне поля зрения научного сообщества вплоть до Второй мировой войны , когда во время немецкой оккупации Голландии открытие Цернике было использовано для создания первых фазово-контрастных микроскопов. В течение войны многие производители стали выпускать фазово-контрастные микроскопы, и они стали широко применяться в биологических и медицинских исследованиях.

Ссылки

Источники

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Фазово-контрастная микроскопия" в других словарях:

См. Микроскопия в фазово контрастном микроскопе. (Источник: «Словарь терминов микробиологии») … Словарь микробиологии

Метод микроскопического исследования, основанный на получении с помощью специальных приспособлений контрастного изображения различающихся по плотности структур бесцветных прозрачных микрообъектов, например живых микроорганизмов и тканевых …

ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ - фазово контрастная микроскопия, см. Микроскоп, Микроскопическая техника … Ветеринарный энциклопедический словарь

фазово-контрастная оптическая микроскопия - 4.34 фазово контрастная оптическая микроскопия (phase contrast optical microscopy): Метод микроскопического анализа, основанный на преобразовании дифференциальных фазовых сдвигов световых волн, проходящих через образец, в различие амплитуд.… … Словарь-справочник терминов нормативно-технической документации

М. живых неокрашенных объектов, при которой контрастность изображения повышают путем превращения фазовых различий прошедшего сквозь объект пучка световых лучей в амплитудные … Большой медицинский словарь

Общее название методов наблюдения в микроскоп неразличимых человеческим глазом объектов. Подробнее см. в ст. (см. МИКРОСКОП). Физический энциклопедический словарь. М.: Советская энциклопедия. Главный редактор А. М. Прохоров. 1983 … Физическая энциклопедия

Совокупность методов изучения малых объектов с помощью микроскопов. К традиционным видам М. относятся–люминесцентная М. – основана на явлении фотолюминесценции, возникающей при окраске препаратов специальными люминесцентными красителями;… … Словарь микробиологии

Схема темнопольной микроскопии в падающем свете. Подсветка образца осуществляется сбоку (зеленая линия). Изображение создается светом, рассеивающимся на неоднородностях образца. Темнопольная микроскопия вид оптическ … Википедия

Метод исследования главным образом живых малоконтрастных объектов (простейших, бактерий, клеток в культуре) посредством аноптрального микроскопа (изобретён в 1953 финским физиологом А. Вильска) разновидности фазово контрастного микроскопа … Большая советская энциклопедия

Способы изучения различных объектов с помощью микроскопа. В биологии и медицине эти методы позволяют изучать строение микроскопических объектов, размеры которых лежат за пределами разрешающей способности глаза человека. Основу М.м.и. составляет… … Медицинская энциклопедия

ФАЗОВО-КОНТРАСТНАЯ МИКРОСКОПИЯ - способ микроскопического исследования прозрачных, не поглощающих света объектов, основанный на усилении контраста изображения.

Прозрачные, не окрашенные объекты (живые и фиксированные микроорганизмы, клетки и др.), отличающиеся от окружающей среды по показателю преломления, не поглощают света, но изменяют его скорость и, следовательно, фазу световых колебаний. Причем степень этих изменений зависит от величины показателя преломления и толщины структур объекта. Однако эти изменения не воспринимаются глазом, не регистрируются фотоматериалами, и исследуемые объекты при световой микроскопии почти не отличаются от фона. Для усиления контрастности изображения применяют фазово-контрастная микроскопия. Ее широко используют для прижизненного изучения микроорганизмов, простейших, клеток растений и животных. В гематологии, например, фазово-контрастную микроскопию применяют для подсчета и дифференциации клеток, изучения их подвижности, дифференциальной диагностики лейкозов и др.

Способ превращения фазовых изменений в соответствующие им амплитудные был предложен в 30-х годов 20 века голландским физиком Зернике (F. Zernike). Принцип фазово-контрастной микроскопии заключается в том, что свет, не отклоненный объектом, проходит через нанесенное на одну из линз объектива фазовое кольцо, смещающее его фазу на четверть длины волны и ослабляющее его интенсивность (для того, чтобы уравнять ее с интенсивностью дифрагированного объектом света), а дифрагированный (отклоненный) свет проходит мимо фазового кольца (см. Микроскоп).

Прохождение прямого, не дифрагированного объектом света через фазовое кольцо обеспечивается находящейся в конденсоре кольцевой диафрагмой, проекция к-рой в плоскости выходного зрачка объектива равна по диаметру и ширине фазовому кольцу и должна полностью совпадать с ним. Для каждого объектива имеется своя кольцевая диафрагма.

В плоскости изображения происходит интерференция световых волн, прошедших и не прошедших через фазовое кольцо. При этом возникают различия в амплитуде, отражающие изменения фазы в зависимости от свойств участков объекта. В отличие от фазовых амплитудные изменения световых волн хорошо видны глазом и могут быть зарегистрированы.

В зависимости от способа изготовления фазового кольца фаза прямого, не дифрагированного объектом света может либо опережать фазу дифрагированного, либо отставать от нее. При этом возникает или наиболее распространенный позитивный фазовый контраст, где частицы с показателем преломления большим, чем у окружающей среды (более плотные), выглядят темными на светлом фоне, или негативный, где такие же частицы дают изображение светлее окружающего фона. Необходимо, однако, отметить, что эта картина сохраняется только до определенной величины показателя преломления, а после достижения этой величины происходит инверсия контраста, то есть наблюдаются обратные закономерности.

Фазово-контрастное устройство (в частности, КФ-4, выпускаемое в нашей стране) состоит из объективов, на одну из линз которых нанесено фазовое кольцо, конденсора с револьверным диском, содержащим набор кольцевых диафрагм, и центрировочным приспособлением, а также вспомогательного микроскопа (рис. 1), с помощью которого в плоскости выходного зрачка объектива можно наблюдать за совмещением фазового кольца и проекции кольцевой диафрагмы конденсора. Это устройство может быть установлено на любой микроскоп.

Существует ряд конструктивных разновидностей фазово-контрастных устройств: с одной кольцевой диафрагмой для всех объективов при использовании панкратического конденсора (например, в отечественных микроскопах МБИ-6, МБИ-15), с так называемым вынесенным зрачком, при котором фазовое кольцо помещается вне объектива, что позволяет использовать для фазово-контрастной микроскопии обычные объективы (такое устройство имеется в отечественных микроскопах МБИ-13, МБИ-17). Выпускаются также устройства с переменным фазовым контрастом (с двумя кольцами разного диаметра).

Одной из разновидностей негативного фазового контраста является аноптральное (фазово-темнопольное) устройство. Аноптральное устройство было создано в 1953 году Вильской (A. Wilska) и используется для изучения объектов, вносящих небольшой сдвиг фазы. Модификация этого метода была предложена М. А. Пешковым и широко использовалась у нас в стране.

Методика приготовления препаратов для фазово-контрастной микроскопии зависит от объекта исследования и длительности его изучения: неокрашенные микроорганизмы можно рассматривать в препаратах раздавленная капля (см.), для длительного наблюдения и кинорегистрации размножения микроорганизмов используют специальные агаровые.микрокамеры (см.) на предметных стеклах (камера Фонбрюна, HI-образная камера Пешкова). Для изучения динамики процессов в однослойных культурах ткани также применяют микрокамеры (стационарные и перфузионные). Очень важными факторами, в значительной мере определяющими качество изображения, являются толщина препарата и различия в показателях преломления объекта и среды.

Техника фазово-контрастной микроскопии сравнительно проста: объективы и конденсор микроскопа заменяют на специальные (на отечественных фазово-контрастных объективах имеется обозначение Ф, на зарубежных - Ph), диск конденсора устанавливают в положение О (то есть сквозное отверстие без кольцевой диафрагмы), на предметный столик помещают препарат, настраивают свет по Келеру (см. Микроскопические методы исследования), вращением диска вводят кольцевую диафрагму, соответствующую увеличению объектива. Вместо окуляра устанавливают вспомогательный микроскоп. Выдвигая его верхнюю часть, получают резкое изображение фазового кольца и кольцевой диафрагмы. Центрировочными винтами конденсора точно совмещают оба кольца, после чего вместо вспомогательного микроскопа устанавливают окуляр. При смене препарата целесообразно проверить совмещение колец (рис. 2).

Достоинством фазово-контрастной микроскопии является возможность проводить прижизненные наблюдения (без какой-либо обработки) биол. объектов, напр, макрофагов (рис. 3), а недостатком - возникновение светлого (в случае позитивного контраста) или темного (в случае негативного) ореола вокруг объекта и его структур. Более полная информация может быть получена при сочетании фазово-контрастной и люминесцентной микроскопии при применении как иммунолю-минесцентного (см. Иммунофлюоресценция), так и люминесцентно-цитохимического метода (см. Люминесцентная микроскопия). При работе с люминесцирующими сыворотками фазово-контрастной микроскопии позволяет убедиться в наличии микрообъекта в том случае, если он не связывает люминесцирующие антитела, а также изучать объекты, у которых антитела фиксируются на отдельных структурах.

Особенно большую роль в прижизненном цитологическом изучении динамики различных физиологических и патологических процессов в клеточной биологии, микробиологии, вирусологии сыграло сочетание фазово-контрастной и аноптральной микроскопии с микрокиносъемкой (см.). Этот метод был использован для изучения цитологии бактерий и простейших, митоза в различных клетках, цитопатического действия вирусов и риккетсий на клетки. Были также изучены особенности образования и развития L-форм бактерий и микоплазм, действие антибиотиков на бактерии.

Библиогр.: Кравченко А. Т., Милютин В. Н. и Гудима О. С. Микрокиносъемка в биологии, М., 1963; Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней, под ред. К. И. Матвеева, с. 5, 25, М., 1973; Скворцов Г. Е. и др. Микроскопы, Л., 1969; Франсон М. Фазовоконтрастный и интерференционный микроскопы, пер. с франц., М., 1960; Cinemic-rography in cell biology, ed. by G. G. Rose, N. Y.-L., 1963; Zernike F. Diff-raktion theory of the knife edge test and its improved form of the phase contrast method, Physica, v. 1, p. 689, 1934.

М. Я. Корн, E. С. Станиславский.

Метод фазового контраста и его разновидность - т. н. метод «аноптрального» контраста предназначены для получения изображений прозрачных и бесцветных объектов, невидимых при наблюдении по методу светлого поля. К таковым относятся, например, живые неокрашенные животные ткани. Суть метода в том, что даже при очень малых различиях в показателях преломления разных элементов препарата световая волна, проходящая через них, претерпевает разные изменения по фазе (приобретает т. н. фазовый рельеф). Не воспринимаемые непосредственно ни глазом, ни фотопластинкой, эти фазовые изменения с помощью специального оптического устройства преобразуются в изменения амплитуды световой волны, т. е. в изменения яркости («амплитудный рельеф»), которые уже различимы глазом или фиксируются на фоточувствительном слое. Иными словами, в получаемом видимом изображении распределение яркостей (амплитуд) воспроизводит фазовый рельеф. Получаемое таким образом изображение называется фазово-контрастным.

Типичная схема работы метода: в переднем фокусе конденсора устанавливается апертурная диафрагма, отверстие которой имеет форму кольца. Её изображение возникает вблизи заднего фокуса объектива, и там же устанавливается т. н. фазовая пластинка, на поверхности которой имеется кольцевой выступ или кольцевая канавка, называемая фазовым кольцом. Фазовая пластинка не всегда помещена в фокусе объектива – часто фазовое кольцо наносят прямо на поверхность одной из линз объектива. В любом случае неотклонённые в препарате лучи от осветителя, дающие изображение диафрагмы, должны полностью проходить через фазовое кольцо, которое значительно ослабляет их (его делают поглощающим) и изменяет их фазу на /4 ( - длина волны света). А лучи, даже ненамного отклоненные (рассеянные) в препарате, проходят через фазовую пластинку, минуя фазовое кольцо, и не претерпевают дополнительного сдвига фазы. С учётом фазового сдвига в материале препарата полная разность фаз между отклоненными и неотклонёнными лучами близка к 0 или /2, и в результате интерференции света в плоскости изображения препарата они заметно усиливают или ослабляют друг друга, давая контрастное изображение структуры препарата. Отклоненные лучи имеют значительно меньшую амплитуду по сравнению с неотклонёнными, поэтому ослабление основного пучка в фазовом кольце, сближая значения амплитуд, также приводит к большей контрастности изображения. Метод дает возможность различать малые элементы структуры, чрезвычайно слабо контрастные в методе светлого поля. Прозрачные частицы, сравнительно не малые по размерам, рассеивают лучи света на столь небольшие углы, что эти лучи проходят вместе с неотклонёнными через фазовое кольцо. Для таких частиц фазово-контрастный эффект имеет место только вблизи их контуров, где происходит сильное рассеяние.